Optymalizacja elementów innowacyjnego biosensora DNA opartego na pomiarach powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana

Rosnące zapotrzebowanie na precyzyjną detekcję specyficznych fragmentów DNA, w tym sekwencji z mutacjami, wynika z kluczowej roli tej identyfikacji w doborze metod leczenia. Obecne techniki, jak PCR czy NGS, mimo skuteczności są czasochłonne i złożone, stąd poszukiwanie szybszych, prostszych rozwiązań. Spektroskopia powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania ramanowskiego (SERS) oferuje wysoką czułość dzięki wzmocnieniu pola elektrycznego w pobliżu nanostruktur plazmonicznych, umożliwiając detekcję nawet pojedynczych cząsteczek.

W 2019 r. zespoły prof. Kudelskiego i prof. Nowickiej opracowały strategię identyfikacji mutacji genowych SERS, opartą na hybrydyzacji jednoniciowego DNA (ssDNA) unieruchomionego na powierzchni złota. Hybrydyzacja zmieniała konformację warstwy łącznikowej i zabezpieczających alkanotioli, co powodowało zmiany w widmach SERS. Były one niewielkie, co wskazywało na potrzebę optymalizacji.

Celem mojej pracy było zrozumienie mechanizmu zmian struktury warstwy ω-podstawionych alkanotioli indukowanych hybrydyzacją DNA oraz identyfikacja warunków maksymalizujących efekt. W części teoretycznej omówiłam podstawy SERS, materiały plazmoniczne, budowę DNA, rolę mutacji i rodzaje biosensorów SERS. Część badawcza obejmowała optymalizację sensora monitorującego zmiany konformacyjne alkanotioli metodą SERS.

Porównałam złoto, srebro i ich stopy, wskazując srebro jako najlepszy materiał dzięki lepszemu stosunkowi sygnału do szumu i większym zmianom intensywności pasm ν(C–S). Optymalizowałam grubość warstwy metalu, rodzaj nanostrukturyzacji i parametry pomiarowe, zapewniając powtarzalność wyników. Na zoptymalizowanym czujniku przeprowadziłam badania klinicznych próbek DNA, obejmujących sześć wariantów mutacji. Stwierdziłam, że dla niektórych sekwencji istotny jest wkład drgania pierścieniowego adeniny, co nie było wcześniej uwzględniane w analizach.

Opracowany czujnik osiągnął granicę wykrywalności <10 fg/μL dla wszystkich badanych mutacji. Analiza długości łańcuchów alkanotioli wykazała, że dłuższe (C6) ułatwiają obserwację zmian konformacyjnych względem krótszych (C3), zwiększając czułość sensora.

Uzyskane wyniki stanowią krok w kierunku opracowania bardziej czułych biosensorów SERS DNA i rozwinięcia precyzyjnych metod diagnostyki molekularnej.

There is growing demand for precise detection of specific DNA fragments, including sequences containing mutations, due to their key role in selecting appropriate treatment methods. Current techniques, such as PCR and NGS, despite their effectiveness, are time-consuming and complex, prompting the search for faster and simpler alternatives. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectroscopy offers high sensitivity thanks to the local enhancement of the electric field near plasmonic nanostructures, enabling detection of even single molecules.

In 2019, the teams of Prof. Kudelski and Prof. Nowicka developed a strategy for genetic mutation identification using SERS, based on the hybridization of single-stranded DNA (ssDNA) immobilized on a gold surface. Hybridization altered the conformation of the linker layer and the protective alkanethiols, producing changes in SERS spectra. These changes were relatively small, indicating the need for further optimization.

The aim of my work was to understand the mechanism of ω-substituted alkanethiol layer rearrangements induced by DNA hybridization and to identify conditions maximizing this effect. The theoretical section reviews the fundamentals of SERS, plasmonic materials, DNA structure, the role of mutations, and types of SERS biosensors. The research section focuses on optimizing a sensor that monitors hybridization-induced conformational changes in alkanethiols using SERS.

I compared gold, silver, and their alloys, identifying silver as the most promising material due to its superior signal-to-noise ratio and larger changes in ν(C–S) band intensity. I optimized the thickness of the plasmonic metal layer, the type of nanostructuring, and measurement parameters to ensure reproducibility. The optimized sensor was tested on clinical DNA samples covering six genetic mutation variants. I found that, for some sequences, the contribution of adenine ring vibrations plays a significant role in interpreting SERS results—a factor not previously considered in such analyses.

The developed sensor achieved a detection limit below 10 fg/μL for all studied mutations. Analysis of the carbon chain length used for immobilizing capture ssDNA and blocking free metal surface sites showed that longer alkanethiols (C6) facilitated observation of hybridization-induced conformational changes compared to shorter analogues (C3), increasing sensor sensitivity.

These results represent a step toward the development of more sensitive SERS DNA biosensors and the advancement of precise molecular diagnostic methods