Synteza analogów 1 α,25-dihydroksywitaminy D3 ze zmodyfikowanym pierścieniem D

Historia odkrycia związku, który dziś nazywamy kalcytriolem, lub bardziej systematycznie, 1,25-dihydroksywitaminą D3, sięga XVIII wieku. Wtedy to, w Anglii miała miejsce tzw. rewolucja przemysłowa. Był to złożony proces społecznoekonomiczny, podczas którego ludność masowo migrowała do miast by pracować w powstałych tam fabrykach. Specyficzny klimat, duże zadymienie oraz dieta oparta głównie na produktach mącznych, spowodowały masowe wystąpienie krzywicy u dzieci. Badania na temat przyczyny tak wysokiej zachorowalności doprowadziły do odkrycia witaminy D3. Jak się później okazało, jest to prekursor aktywnej biologicznie formy, jaką jest kalcytriol. Związek ten jest nazywany hormonem witaminowym ze względu na sposób działania i mnogość funkcji, jakie spełnia w organizmie. Do głównych można zaliczyć kontrolę homeostazy wapniowo-fosforanowej i przeciwdziałanie chorobom autoimmunologicznym, takim jak łuszczyca. Coraz częściej jednak jest również podkreślana znaczna rola kalcytriolu w odporności oraz przeciwdziałaniu zmianom nowotworowym. Nic więc dziwnego, że wiele zespołów naukowych skupionych w ośrodkach akademickich, jak i firmach farmaceutycznych, zajęło się syntezą pochodnych witaminy D3 oraz kalcytriolu. Poszukiwano i poszukuje się nadal związków posiadających unikalny profil biologiczny, charakteryzujący się selektywnym i/lub wzmocnionym działaniem terapeutycznym. Analizując doniesienia literaturowe na temat analogów 1,25-dihydroksywitaminy D3, można zauważyć, że tylko nieliczne z nich dotyczą związków z modyfikacjami steroidowego pierścienia D. Postanowiłem zatem skupić sięna poszerzeniu wiedzy na temat możliwości syntez pochodnych kalcytriolu, charakteryzujących się takimi strukturalnymi modyfikacjami. Jako pierwszy cel syntetyczny obrałem analog z aromatycznym, sześcioczłonowym pierścieniem D. Związek ten posiadał ponadto zmodyfikowany układ podwójnych wiązań. Tak więc, typowy układ trienowy zamieniłem na dienowy, który nieco obniża aktywność biologiczną, znacznie natomiast upraszcza syntezę. Podczas realizacji pożądanego produktu użyłem -tetralon jako związek wyjściowy, będący jednocześnie fragmentem zawierającym bicykliczny układ pierścieni C/D. W trakcie dobudowywania łańcucha bocznego wykorzystałem asymetryczną epoksydację Sharplessa, dzięki której w sposób wydajny i w pełni stereokontrolowany utworzyłem centrum stereogeniczne na C-20. Kluczową reakcją była również reakcja Sonogashiry, która umożliwiła wydajne sprzęgnięcie tryflanu zawierającego „górny” fragment budulcowy z dienynem będącym syntonem pierścienia A. Wykorzystując różne bloki budulcowe zawierające pierścień A, otrzymałem dwa związki finalne. Pierwszy z nich zawierał pierścień A, identyczny z tym występującym w formie prewitaminowej kalcytriolu. W drugim, zsyntezowanym według autorskiego projektu, występowała dodatkowa grupa metylenowa w pozycji C-2. Analizując ponownie dotychczasowe doniesienia literaturowe postanowiłem zsyntezować kolejną grupę analogów, w których główną modyfikacją był pierścień D w formie otwarto-łańcuchowej (związki D-seko). Dodatkowymi strukturalnymi zmianami, w porównaniu do kalcytriolu, było wprowadzenie podwójnego wiązania pomiędzy C-17 a C-20, brak grupy metylowej przy C-20, oraz brak grupy metylenowej przy C-10. W tej grupie pochodnych postanowiłem otrzymać -oprócz związków z „naturalną” konfiguracją absolutną - również diastereomery, które posiadały odwrotną konfigurację na centrach C-13 oraz C-14. Wśród tej ostatniej podgrupy była również pochodna z pierścieniem A identycznym z kalcytriolowym. Kluczową reakcją w trakcie realizacji projektu była ponownie reakcja Sharplessa, która ostatecznie pozwoliła w sposób w pełni stereokontrolowany wprowadzić trzy centra stereogeniczne w chiralnym związku, powstałym z -kaprolaktonu. Dzięki zastosowaniu D- lub L-winianu otrzymałem odpowiedni stereoizomer. Wykorzystując reakcję Wittiga-Hornera połączyłem keton zawierający „górny” fragment analogu z odpowiednim tlenkiem fosfiny zawierającym pierścień A. W przypadku pochodnej z „naturalnym” pierścieniem A, sprzęganie dużych fragmentów wykonałem za pomocą reakcji Sonogashiry, przekształcając uprzednio keton w odpowiedni tryflan. Dla wszystkich zsyntezowanych przeze mnie analogów kalcytriolu wykonane zostały badania biologiczne. Przetestowana została zdolność wiązania tych związków z receptorem witaminy D (VDR) oraz zdolność różnicowania komórek ludzkiej białaczki linii HL-60. Dla wybranych związków wykonano testy funkcjonalne pod kątem aktywacji transkrypcji 24-hydroksylazy oraz testy in vivo określające właściwości kalcemiczne. Uzupełnieniem prowadzonych przeze mnie badań nad analogami kalcytriolu ze zmodyfikowanym pierścieniem D, była synteza pochodnych hydrindanu i dekaliny, które mogą posłużyć jako syntony zawierające bicykliczny układ pierścieni C/D. Związki te posiadały podwójne wiązanie C(15)-C(16)(w numeracji steroidowej), co umożliwia dalszą funkcjonalizację w tym miejscu cząsteczek. Przedstawiona praca doktorska poszerza wiedzę na temat zależności strukturaaktywność w obszarze badań nad 1,25-dihydroksywitaminą D3. Niewątpliwym atutem przedstawionych badań są wyniki otrzymane dla jej analogów posiadających modyfikacje strukturalne w steroidowym pierścieniu D, rzadko dotychczas eksplorowanym fragmencie cząsteczek witamin grupy D. Wyniki zaprezentowane w niniejszej rozprawie zostały częściowo opublikowane w formie artykułów: 1. Sibilska I. K., Szybinski M., Sicinski R. R., Plum L. A., DeLuca H. F., J. Steroid Biochem. Mol. Biol, 136, 9-13 (2013). IF= 4.095 2. Sibilska I. K., Szybinski M., Sicinski R. R., Plum L. A., DeLuca H. F., J. Med. Chem., 58, 9653-9662 (2015). IF= 6.253 3. Szybinski M., Sokołowska K., Sicinski R. R., Plum L. A., DeLuca H. F., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 173, 57-63 (2017). IF= 4.095 4. Szybinski M., Sektas K., Sicinski R. R., Plum L. A., Frelek J., DeLuca H. F., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 171, 144-154 (2017). IF= 4.095 5. Szybinski M., Brzeminski P., Fabisiak A., Berkowska K., Marcinkowska E., Sicinski R. R., Int. J. Mol. Sci., 18, 2162-2176 (2017). IF= 3.687

The history of the discovery of calcitriol, i.e., 1α,25-dihydroxyvitamin D3, dates back to the eighteenth century when the industrial revolution began in England. It was a complex socio-economic process, during which the population was massively migrating to the cities to work in the factories created at that time. The specific climate, large smokiness, and diet based mainly on farinaceous products caused a massive occurrence of rickets in children. Research on the cause of such a high incidence has led to the discovery of vitamin D3. As it turned out later, this was a precursor of a biologically active form, named calcitriol. This compound is considered as a vitamin D hormone due to its mode of action and a multitude of functions it performs in the body. The main ones include the control of calcium-phosphate homeostasis and prevention of autoimmune diseases such as psoriasis. The role of calcitriol in the immunological system was also discovered. Therefore, this is not surprising that many scientific teams gathered in academy and industry attempted to synthesize calcitriol analogues characterized by selective and/or enhanced therapeutic effects. Reviewing literature reports on the synthesis of 1α,25- dihydroxyvitamin D3 analogues, one can see that only few publications describe the synthesis of calcitriol analogues with the modified steroidal D ring. Therefore, I decided to expand our knowledge about the possibility of the synthesis of different calcitriol derivatives with D-ring modifications. As the first synthetic target, I selected the analogue with an aromatic, six-membered D ring. This compound additionally had a modified double bond system. I replaced a “natural” triene system with the diene fragment, which usually slightly decreases the biological activity, but significantly simplifies the synthesis. I used α-tetralone as the starting compound, containing a bicyclic C/D ring system. During the addition of the side chain, I used the Sharpless asymmetric epoxidation, that allowed to create a stereogenic centre on C-20 in an efficient and fully stereocontrolled manner. The Sonogashira reaction was also a key process, which enabled me to couple a triflate containing the "upper" fragment with the dienyne being the A-ring synthon. Using various building blocks containing the A ring, I obtained two final compounds. The first one possessed the A ring identical to that one present in the previtamin form of calcitriol. The second, synthesized according to the original project, was characterized by the presence of an additional methylene group at the C-2 position. After analysing the previous literature reports, I decided to synthesize another group of calcitriol analogues, in which the main structural modification was the D ring in the open-chain form (D-seco). Additional structural changes – as compared to calcitriol – comprised introduction of a C(17)-C(20) double bond, lack of methyl group at C-20 and lack of methylene group at C-10. Among these derivatives, I decided to create compounds with a "natural" absolute configuration, and also diastereomers that had the reverse configuration at C-13 and C-14 stereogenic centres. In the latter subgroup, there was also a derivative with its A ring identical with that of calcitriol. The key reaction during the project was again the Sharpless asymmetrical epoxidation, which enabled the stereocontrolled introduction of three stereogenic centres into a chiral compound derived from -caprolactone. Using the D- or Ltartrate in this process resulted in the desired stereoisomer. Utilizing the Wittig- Horner reaction, I coupled a ketone containing the "upper" building block of the analogue with an appropriate A-ring phosphine oxide derivative. In the case of a derivative having the "natural" A ring, coupling of large fragments was carried out by the Sonogashira reaction performed after converting the ketone into the respective enol triflate. Biological testing was performed for all the synthesized analogues. The affinity of new compounds to bind the vitamin D receptor (VDR) and their ability to differentiate human leukaemia HL-60 cells have also been tested. For the selected compounds, additional tests were performed such as activation of 24-hydroxylase transcription and in vivo tests indicating calcaemic potency. My research on calcitriol analogues with the modified D ring was extended to the synthesis of hydrindane and decalin derivatives, that can be used as synthons containing the bicyclic C/D-ring system. These compounds have a C(15)-C(16) double bond (according to the steroid numbering), which allows further functionalization in the ring D. The presented doctoral dissertation expands the knowledge about the structureactivity relationship in the vitamin D area. Undoubtedly, advantages that arise from the presented research are the results obtained for the calcitriol analogues characterized by structural modifications in their steroidal ring D, being rarely explored structural fragment of the vitamin D molecules.