Synteza podwójnie funkcjonalizowanych dinukleotydowych analogów końca 5’ mRNA (tzw. kapu)

Informacyjny kwas rybonukleinowy organizmów eukariotycznych i niektórych wirusów posiada na swoim końcu 5’ unikalną strukturę zwaną kapem. Powstaje ona na wczesnym etapie transkrypcji i uczestniczy w wielu ważnych procesach takich jak splicing, poliadenylacja czy transport do cytoplazmy, gdzie pośredniczy we włączaniu mRNA w proces translacji. Kap przyczynia się również do ochrony przed degradacją enzymatyczną eukariotycznego mRNA. Analogi końca 5’ mRNA z uwagi na ich potencjalne zastosowanie terapeutyczne od lat poddaje się różnorakim modyfikacjom wpływającym na pełnione przez kap funkcje np.: zwiększając jego odporność na degradację enzymatyczną czy polepszając właściwości inhibitorowe procesu translacji. Projektuje i otrzymuje się również analogi kapu stanowiące narzędzia molekularne, które nie mają na celu zmiany podstawowej jego roli, tylko umożliwienie zastosowania nowych technik biochemicznych czy biofizycznych w badaniach mechanizmów procesów, w których kap uczestniczy. Jonowa struktura końca 5’ mRNA utrudnia jego translokację przez błonę komórkową, co znacznie ogranicza jego zastosowanie praktyczne. Dlatego też, pożądana jest również funkcjonalizacja analogów kapu w sposób umożliwiający jego transport. Dotychczas zaproponowano analogi końca 5’ mRNA posiadające tylko pojedynczą funkcjonalizację między innymi znacznikami fluorescencyjnymi. Natomiast przydatnym narzędziem w różnych badaniach byłoby otrzymanie analogów posiadających dołączone dwie cząsteczki pełniące różne, dodatkowe funkcje. Jedna z nich umożliwiłaby przykładowo transport analogu przez błonę komórkową a druga jego lokalizację komórkową. Podczas badań prowadzonych w ramach pracy doktorskiej zsyntezowane zostały podwójnie funkcjonalizowane, w obrębie drugiego nukleotydu, dinukleotydowe analogi kapu. Otrzymane analogi końca 5’ mRNA posiadały dwie z trzech wybranych grup funkcyjnych (karboksylowa, alkinowa oraz tiolowa) z których każda wprowadzona była w określoną pozycję w obrębie drugiego nukleozydu. Wybrane modyfikacje umożliwiają selektywną funkcjonalizację z zastosowaniem między innymi wiązania amidowego, cykloaddycji pomiędzy azydkiem i alkinem oraz wiązania disiarczkowego. Dwie pierwsze metody sprzęgania znane są i stosowane w chemii nukleotydów, natomiast synteza wiązania disiarczkowego wymagała znalezienia odpowiednich metod a następnie ich optymalizacji oraz opracowania warunków izolacji i oczyszczania uzyskanych produktów. Umożliwiło to otrzymanie funkcjonalizowanej poprzez mostek disiarczkowy 6-tioguanozyny na poziomie nukleozydu, mononukleotydu oraz dinukleotydu, w tym analogu kapu. Ponadto, otrzymany podwójnie funkcjonalizowany dinukleotydowy analog końca 5’ mRNA z dołączonym peptydem penetrującym błonę komórkową oraz znacznikiem fluorescencyjnym został wykorzystany w badaniach biologicznych pokazujących, że może on wnikać do komórki oraz hamować inicjację translacji, co wskazuje na użyteczność wprowadzonych modyfikacji.

All cellular eukaryotic mRNAs have at their 5’ end a unique structure known as a cap. It is formed at an early stage of transcription and participates in many important processes such as splicing, polyadenylation and cytoplasmic transport, where cap mediates the incorporation of mRNA into the translation process. Cap also participates in the protection of eukaryotic mRNA against enzymatic degradation. Analogs of the 5' end of mRNA due to their potential therapeutic use have been subjected to various modifications affecting the functions performed by cap, e.g. increasing its resistance to enzymatic degradation or improving inhibitory properties of the translation process. Cap analogs are also designed and obtained as molecular tools, which are not intended to change its basic role, but to enable the use of new biochemical or biophysical techniques in studying the mechanisms of processes in which cap participates. The ionic structure of the 5' end of mRNA hinders its translocation across the cell membrane, which significantly limits practical use. Therefore, functionalization of cap analogues in a way that facilitates its transport is also desirable. To date, cap analogs having only a single functionalization, for example with fluorescent labels, have been presented. However, it would be desirable to obtain mRNA cap analogs having two different molecules attached which would change them into useful in various studies molecular tools. One of the molecules would allow the transport of an analog across a cell membrane and the other its cell location. During the research conducted as part of the doctoral dissertation, doubly functionalized, within the second nucleotide, dinucleotide cap analog were synthesized. The resulting mRNA cap analogs had two of the three selected functional groups (carboxyl, alkyne and thiol), each of which was introduced into a specific position within the second nucleoside. Chosen modifications allow selective functionalization using amide bond, alkyne-azide cycloaddition and disulfide bond. The first two coupling methods are known and used in nucleotide chemistry, while the synthesis of disulfide bond required finding appropriate methods and then their optimization and the development of conditions for the isolation and purification of the obtained products. It made it possible to obtain 6-thioguanosine functionalized via a disulfide bridge at the level of nucleoside, mononucleotide and dinucleotide, including the cap analogue. In addition, the resulting double functionalized dinucleotide cap analog with attached cell penetrating peptide and fluorescent label has been used in biological studies showing that such cap analog can enter the cell and inhibit translation initiation, indicating the usefulness of introduced modifications.