Transcriptomic analysis of the differential action of mitomycin C on ovarian cancer cells under different oxygen availability

Rak jajnika (RJ) obecnie jest jednym z najbardziej agresywnych nowotworów ginekologicznych. Zajmuje ósme miejsce zarówno pod względem zachorowalności i ilości zgonów, i tym samym charakteryzuje się największą śmiertelnością wśród nowotworów żeńskiego układu rozrodczego. Pomimo wielu obiecujących wyników badań przedklinicznych opracowujących nowe terapie przeciwnowotworowe dla RJ, często rezultaty tych badań nie znajdują odzwierciedlenia w praktyce klinicznej. Jedną z przyczyn obserwowanych różnic może być brak uwzględnienia mikrośrodowiska guza, w szczególności hipoksji (pO2=1%), odgrywającej kluczową rolę w rozwoju wielu nowotworów. Oprócz standardowej chemioterapii, opartej na taksanach i pochodnych platyny stosowanej u chorych na RJ, podejmowane są próby leczenia innymi lekami. Jednym z nich jest mitomycyna C (MMC), antybiotyk o działaniu przeciwnowotworowym. Wiedza na temat działania tego leku na komórki RJ jest ograniczona, zwłaszcza w warunkach odzwierciedlających hipoksyjne mikrośrodowisko guza. Celem niniejszych badań było określenie wpływu MMC na komórki linii komórkowej ludzkiego RJ SKOV3 w warunkach normoksji (pO2~19%) i hipoksji, ze szczególnym zwróceniem uwagi na analizę transkryptomiczną, z uwzględnieniem zmian zachodzących w alternatywnym splicingu (AS). W tym celu komórki RJ SKOV3 poddano MMC w warunkach normoksji i hipoksji. Otrzymane wyniki opisują wpływ MMC na biologię komórek SKOV3, w tym: antymitotyczny, cytotoksyczny i antyangiogenny efekt MMC, akumulację komórek SKOV3 w fazie S cyklu komórkowego oraz indukcję cech przejścia epitelialno-mezenchymatycznego pod wpływem działania MMC. Analiza transkryptomiczna zidentyfikowała geny i szlaki sygnałowe charakterystyczne dla działania MMC w normoksji (związane z biogenezą rybosomów) i w hipoksji (związane z modyfikacją macierzy zewnątrzkomórkowej) wraz z możliwymi regulatorami wyłonionymi na podstawie różnic w odpowiedzi na lek w normoksji i hipoksji. Niektóre ze zidentyfikowanych genów zostały po raz pierwszy opisane w kontekście RJ i hipoksji lub MMC. Przedstawione w pracy dane wskazują na indukcję procesu starzenia pod wpływem MMC, przy czym z zaangażowaniem odrębnych szlaków w normoksji i hipoksji. Ponadto, zidentyfikowano geny związane z glikozylacją, których ekspresja była zmieniona pod wpływem MMC i hipoksji. Analiza rodzajów alternatywnego splicingu (AS), pokazała ich zróżnicowaną dystrybucję w każdym z badanych porównań oraz umożliwiła określenie wpływu AS na obecność wariantów mRNA genu MMP1 oraz jego potencjalny wpływ na budowę białka. Ponadto, zidentyfikowano również czynniki splicingowe, w tym KHDRBS3, prawdopodobnie odpowiedzialne za zwiększony AS w odpowiedzi komórek SKOV3 na hipoksję i MMC. Podsumowując, niniejsze badania podkreślają modyfikujący wpływ niskiego pO2, które zmienia odpowiedź komórek na leki, a tym samym ogólną potrzebę badania działania leków w hipoksji.

Ovarian cancer (OC), an aggressive gynecological malignancy ranked eighth in terms of cancer incidence and mortality, is the most fatal cancer of the female reproductive system. While many preclinical studies show promise for new therapies against OC, they often do not translate into clinical practice. This discrepancy may be due to the lack of consideration of the tumor microenvironmental conditions, particularly the hypoxic state (pO2=1%), which plays a critical role in tumor progression. Apart from standard chemotherapy based on taxanes and platin derivatives used in OC treatment, other drugs are tested. One of them is mitomycin C (MMC), an antineoplastic antibiotic. The existing knowledge about MMC effects on OC cells is limited, and the real, in vivo parameters of its action, like the hypoxic tumor microenvironment (TME), have not been taken into account. This study aimed to elucidate the action of MMC on the biology of human OC SKOV3 cells, comparing its effects in hypoxia to normoxia (pO2~19%), estimated by transcriptomic analysis, including the changes in alternative splicing (AS) events. Ovarian cancer cells SKOV3 were treated with MMC in normoxia (pO2~19%) and in hypoxia (pO2=1%). The effects of MMC on SKOV3 cell biology included antimitotic, cytotoxic and antiangiogenic actions of the drug, accumulation of SKOV3 cells in the S phase of the cell cycle and induction of EMT features upon MMC treatment. The transcriptome analysis identified genes and pathways characteristic for the MMC action in normoxia (related to ribosome biogenesis) and in hypoxia (related to extracellular matrix modification), together with regulation pointed out by the differences between hypoxic and normoxic responses to the drug. Some genes were identified, for the first time, in ovarian cancer cells upon hypoxia and/or MMC action. Data also indicate the induction of senescence by MMC uncovering the involvement of distinct molecular pathways in hypoxia as compared to normoxia. Moreover, glycosylation-related genes responsible for fucosylation of antigens, were differentially expressed upon MMC and hypoxia. Analysis of AS events showed their distribution in each comparison and allowed for prediction of its influence on MMP1 mRNA variants and possible impact on protein structure. Splicing factors such as KHDRBS3, potentially responsible for the increased number of AS events upon hypoxia and MMC, were also identified. In summary, the study underlines the importance of pO2 which alters cancer cell response to the drugs, it thus validates the need for a general approach of the drugs evaluation in hypoxia.