Genomic and physiological characterization of psychrotolerant strains of bacteria capable of leaching and degradation of petroleum hydrocarbons from contaminated soils

Zanieczyszczenie gleby węglowodorami ropopochodnymi stanowi globalny problem, wpływający negatywnie na funkcjonowanie ekosystemów i zdrowie ludzi. Gleba stanowi istotny surowiec, od którego zależna jest produkcja rolna i odgrywa znaczącą rolę w gospodarce o obiegu zamkniętym. Z tych względów, ważna jest ochrona jej jakości a w przypadku jej zanieczyszczenia – skuteczne oczyszczanie z toksycznych substancji. Bioremediacja jest uważana za jedną z metod efektywnego i bezpiecznego oczyszczania skażonego środowiska. Metoda ta opiera się jednak na procesach biologicznych, które mogą być hamowane przez niskie temperatury otoczenia i wysokie poziomy zanieczyszczeń, co prowadzi do wydłużenia czasu remediacji. Propozycją pozwalającą podjąć wyzwania związane z bioremediacją w zimnych środowiskach jest wykorzystanie mikroorganizmów eurytermicznych tolerujących niskie temperatury otoczenia (psychrotolerantów). Takie mikroorganizmy nie wykazują inhibicji procesów metabolicznych w niskich temperaturach, co pozwala na ich wykorzystanie do bioremediacji przez cały rok. Przedmiotem niniejszej pracy było zidentyfikowanie i scharakteryzowanie psychrotolerancyjnych bakterii zdolnych do wymywania i degradacji węglowodorów ropopochodnych ze skażonych gleb. Przetestowano bakterie pozyskane z ekstremalnych środowisk, takich jak antarktyczny staw i skażone ksylenem gleby poprzemysłowe. Środowiska te zostały wybrane ze względu na ich unikalne warunki abiotyczne oraz potencjał do zasiedlenia przez mikroorganizmy o różnych zdolnościach metabolicznych. Ze 168 szczepów wyizolowanych ze stawu wybrano do dalszych analiz trzy: Bacillus ANT_WA51, Pusillimons ANT_WB101 i Dietzia ANT_WB102. Dodatkowo z gleby skażonej ksylenem, z pięciu szczepów wybrano trzy z rodzaju Pseudomonas (X1, X2 i X3). Analizy fizjologiczne wykazały zdolność tych szczepów do wzrostu w temperaturach od 10 °C do 37 °C, pH od 4 do 10 i zasoleniu od 0 do 6% NaCl. Wszystkie szczepy wykazały odporność na zamrożenie, ale odpornością na cykle zamrażania-rozmrażania charakteryzowały się jedynie szczepy antarktyczne. Testy przeprowadzone w skali laboratoryjnej wskazały na potencjał wymywania zanieczyszczeń ropopochodnych przez brzeczkę pohodowlaną szczepu Bacillus ANT_WA51 i potencjał do degradacji węglowodorów przez szczepy Pusillimonas ANT_WB101, Dietzia ANT_WB102, i Pseudomonas X1, X3 i X5. Przeprowadzona analiza bezpieczeństwa biologicznego pozwoliła na identyfikację potencjalnych determinantów wirulencji w genomach, jednakże geny te nie odpowiadały krytycznym czynnikom wirulencji typowym dla poważnych patogenów. Wykazano również obecność determinantów oporności na antybiotyki. Prace w skali pilotażowej z użyciem konsorcjów utworzonych z badanych bakterii (Antarctic-BC, zawierający szczepy ANT_WB101 i ANT_WB102 oraz Xylene DBC, zawierający Pseudomonas X1 i X5), potwierdziły aplikacyjność tych szczepów w bioremediacji gleb zanieczyszczonych węglowodorami i wskazały na możliwość ich całorocznego stosowania. Bioremediacja przeprowadzona w skali laboratoryjnej wykazała, że metabolity produkowane przez Bacillus subtilis ANT_WA51 są skuteczne w wymywaniu węglowodorów ropopochodnych z zanieczyszczonych gleb. Niemniej jednak, pomimo tych obiecujących wyników, konieczna jest ich walidacja poprzez badania w skali pilotażowej. Natomiast badania nad degradacją węglowodorów doprowadziły do opracowania dwóch konsorcjów bakteryjnych Antarctic-BC i Xylene-DBC. Konsorcja te mogą przyczynić się do zwiększenia efektywności procesów biodegradacji i umożliwić wydłużenie okresu możliwych działań bioremediacyjnych o chłodniejsze miesiące, kończąc tym samym etap badań bioprospekcji.

Soil pollution by petroleum hydrocarbons is a global problem, negatively affecting the functioning of ecosystems and human health. Soil is a key resource for agricultural productivity and plays a significant role in a circular economy. Therefore, it is essential to maintain soil quality and effectively remove toxic substances when contamination occurs. Bioremediation can be regarded as one of the effective and environmentally safe methods for treating contaminated environments. However, this method relies on biological processes, which can be inhibited by low ambient temperatures and high levels of contaminants, leading to extended remediation time. The use of microorganisms with eurythermal adaptivity and low temperature tolerance (psychrotolerants) is proposed to address the challenges of bioremediation in cold environments. Low temperatures do not inhibit these microorganisms' metabolic processes, making them suitable for bioremediation throughout the year. This thesis aimed to identify and characterize psychrotolerant bacteria capable of leaching and degrading petroleum hydrocarbons from contaminated soils. Bacteria from extreme environments, such as an Antarctic pond and xylene-contaminated post-industrial soils, were tested. These environments were selected based on their unique abiotic conditions and potential to harbor microorganisms with different metabolic capabilities. Three strains were selected for further analysis from the initial 168 strains isolated from the pond: Bacillus ANT_WA51, Pusillimonas ANT_WB101, and Dietzia ANT_WB102. Additionally, from BTEX-contaminated soil, three strains of the genus Pseudomonas were selected from five strains. Physiological analyses demonstrated that these strains could grow from 10 °C to 37 °C, at pH levels 4 to 10, and in salinity conditions from 0% to 6% of NaCl. While all strains exhibited resistance to freezing, only the Antarctic strains showed resistance to freeze-thaw cycles. Laboratory-scale tests showed that the post-culture medium of strain Bacillus ANT_WA51 had the potential for hydrocarbons contaminant leaching, and strains Pusillimonas ANT_WB101, Dietzia ANT_WB102, and Pseudomonas X1, X3, and X5 demonstrated hydrocarbon degradation capabilities. As a part of the biosafety analysis, potential virulence determinants were identified in the genomes, although these genes did not correspond to the critical virulence factors typically associated with severe pathogens. Furthermore, the presence of determinants for antibiotic resistance was demonstrated. Pilot scale investigations utilizing consortia derived from the tested bacteria (Antarctic BC, which includes the strains Pusillimonas ANT_WB101 and Dietzia ANT_WB102, and Xylene DBC, comprising Pseudomonas strains X1 and X5) validated the effectiveness of these strains in the bioremediation of hydrocarbon-contaminated soils, and indicated their potential for year round application. Lab-scale bioremediation experiments demonstrate that metabolites produced by Bacillus subtilis ANT_WA51 effectively leach petroleum hydrocarbons from contaminated soils. Despite these promising results, validation through pilot-scale studies is necessary. Furthermore, research into hydrocarbon degradation led to the development of two bacterial consortia, Antarctic-BC and Xylene-DBC. These consortia may enhance biodegradation processes and contribute to extending bioremediation activities' feasibility into colder months, effectively completing the bioprospecting stage.