Charakterystyka nowych aktywności enzymatycznych cytozolowej dehydrogenazy (R)-β-hydroksymaślanowej typu 2 (BDH2) ssaków.

Dehydrogenaza (R)-β-hydroksymaślanowa typu 2 (BDH2) została pierwotnie zidentyfikowana jako cytoplazmatyczna forma dehydrogenazy (R)-β-hydroksymaślanowej typu 1 (BDH1), która w mitochondriach katalizuje odwracalne utlenianie (R)-β-hydroksymaślanu do acetylooctanu. Wysokie podobieństwo strukturalne BDH2 do BDH1, a także aktywność rekombinowanego enzymu względem (R)-β-hydroksymaślanu, przemawiały za uznaniem BDH2 jako kolejnego enzymu zaangażowanego w metabolizm ciał ketonowych. W wyniku późniejszych badań zaproponowano, że BDH2 dodatkowo katalizuje powstawanie kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (kwasu gentyzymowego, 2,5-DHBA). Postulowano, że 2,5-DHBA w kompleksie z białkiem lipokaliną 2 (24p3) stanowią hipotetyczny siderofor transportujący żelazo z cytozolu do mitochondrium w komórkach kręgowców. Obecnie obie hipotezy są powszechnie akceptowane, jednak nie znajdują wystarczającego uzasadnienia w świetle dostępnych wyników badań. Nie stwierdzono bowiem u myszy pozbawionych funkcjonalnej BDH2 zaburzeń metabolizmu ciał ketonowych, a sam 2,5-DHBA wykazuje słabe właściwości chelatujące jony żelaza w warunkach fizjologicznych. W niniejszej pracy doktorskiej zidentyfikowano BDH2 jako reduktazę 4-okso-L-prolinową – enzym katalizujący redukcję 4-okso-L-proliny do 4-hydroksy-L-proliny w komórkach ssaków, którego tożsamość molekularna pozostawała nieznana od czasu jego odkrycia w 1959 roku. Wykorzystując homogenne rekombinowane formy BDH2 człowieka oraz szczura przeprowadzono charakterystykę biochemiczną badanej aktywności określając optymalne pH katalizowanej reakcji, specyficzność substratową względem związków strukturalnie zbliżonych do 4-okso-L-proliny oraz (R)-β-hydroksymaślanu, a także wyznaczono parametry kinetyczne redukcji 4-okso-L-proliny. Stosując metody chromatograficzne oraz tandemową spektrometrię mas udowodniono, że produktem aktywności BDH2 jest cis-4-hydroksy-L-prolina, a nie jak dotąd sądzono, izomer trans tego aminokwasu. Zidentyfikowano tym samym pierwszy enzym ssaków, którego aktywność prowadzi do powstania cis-4-hydroksy-L-proliny uważanej dotychczas za związek niefizjologiczny. Ponadto wykazano, że: (I) metabolizm 4-okso-L-proliny w ludzkich komórkach HEK293T jest ściśle zależny od aktywności endogennego białka BDH2 oraz (II) 4-okso-L-prolina lub produkty jej spontanicznej przemiany chemicznej wywierają działanie cytotoksyczne na badane komórki, a redukcja 4-okso-L-proliny katalizowana przez BDH2 może stanowić mechanizm neutralizacji tego szkodliwego metabolitu. Opierając się na wynikach: (I) analiz porównawczych sekwencji aminokwasowej BDH2 z sekwencjami dehydrogenaz bakteryjnych oraz (II) podobieństwie strukturalnym 4-okso-L-proliny, cis-4-hydroksy-L-proliny oraz 2-keto-3-deoksy-L-fukonianu zaproponowano również, że BDH2 może posiadać aktywność dehydrogenazy 2-keto-3-deoksy-L-fukonianowej – enzymu postulowanego szlaku degradacji L-fukozy w komórkach ssaków. Wykorzystując rekombinowane białka ludzkie oraz bakteryjne pozytywnie zweryfikowano tę hipotezę oraz wstępnie scharakteryzowano biochemicznie BDH2 jako dehydrogenazę 2-keto-3-deoksy-L-fukonianową ssaków. Pomimo identyfikacji molekularnej kolejnego enzymu szlaku degradacji L-fukozy, rola fizjologiczna wewnątrzkomórkowego procesu utleniania L-fukozy u ssaków wciąż pozostaje nieznana.

The type 2 (R)-β-hydroxybutyrate dehydrogenase (BDH2) was initially identified as the cytoplasmic form of the mitochondrial dehydrogenase catalyzing reversible oxidation of the (R)-β-hydroxybutyrate into acetoacetate (BDH1). Due to high structural similarity to the BDH1 enzyme, as well as the catalytical activity of the BDH2 with (R)-β-hydroxybutyrate as a substrate, BDH2 was designated as the next enzyme involved in the ketone body metabolism. As a result of further studies, it was proposed that BDH2 catalyzes the biosynthesis of the 2,5- dihydroxybenzoic acid (gentisic acid, 2,5-DHBA). It has been postulated previously that 2,5-DHBA in complex with lipocalin 2 protein (24p3) forms a hypothetical siderophore responsible for iron transportation between cytosol and mitochondria in vertebrate cells. Both hypotheses are widely accepted, however, both are not well proven in the light of available data. Mice without functional BDH2 enzyme do not exhibit disturbance in the ketone body metabolism, and 2,5-DHBA itself express poor chelating properties in physiological conditions. In the following dissertation, BDH2 was identified as a 4-oxo-L-proline reductase – the enzyme responsible for the reduction of 4-oxo-L-proline into 4-hydroxy-L-proline in mammalian cells. The molecular identity of this particular activity remained unknown since its discovery in 1959. Employing purified recombinant human and rat enzymes, the BDH2 protein was characterized biochemically as the 4-oxo-L-proline reductase. The optimal pH of the catalyzed reaction as well as substrate specificity with structural analogs of the 4-oxo-L-proline and (R)-β-hydroxybutyrate was verified. Kinetic parameters of the 4-oxo-L-proline reduction were determined by spectrophotometric assay. The molecular identity of the activity product was shown by LC-MS/MS analysis to be exclusively a cis-4-hydroxy-L-proline and not the trans isomer as believed before. Thus, the BDH2 protein is the first mammalian enzyme identified to be able to produce a cis isomer considered as non-physiological in animals. Moreover, it has been shown (I) in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells that 4-oxo-L-proline metabolism is associated with the presence of functional BDH2 as well as that (II) the 4-oxo-L-proline or products of its spontaneous chemical transformation show cytotoxic activity, and the reduction of 4-oxo-L-proline may be one of the mechanisms to neutralize this harmful metabolite. According to the results (I) of the amino acid sequence comparison between BDH2 and bacterial dehydrogenases as well as (II) the structural resemblance between 4-oxo-L-proline, cis-4-hydroxy-L-proline, and 2-keto-3-deoxy-L-fuconate, in the following work it was proposed that BDH2 may pose an activity of 2-keto-3-deoxy-L-fuconate dehydrogenase – the enzyme of the postulated L-fucose degradation pathway in mammalian cells. Using recombinant human and bacterial proteins, the hypothesis of putative enzymatic activity of the BDH2 protein as mammalian 2-keto-3-deoxy-L-fuconate dehydrogenase was confirmed and the enzyme was preliminarily characterized biochemically. Despite the molecular identification of the next enzyme from the L-fucose degradation pathway, the physiological function of the intracellular oxidation of the L-fucose in mammals remains unresolved.