Synteza i badania biologiczne nowych inhibitorów cholinoesteraz zawierających ugrupowanie serotoniny i wybranych pochodnych heterocyklicznych

Projektowanie nowych inhibitorów cholinoesteraz jest bardzo istotnym elementem poszukiwania leków w chorobie Alzheimera. Wśród obecnie stosowanych farmaceutyków w terapii tej choroby znajduje się m.in. takryna i donepezil, odwracalne inhibitory cholinoesteraz – acetylocholinoesterazy (AChE) oraz butyrylocholinowesterazy (BChE), których pochodne stały się elementami budulcowymi do otrzymania inhibitorów, objętych rozprawą doktorską. Etiologia choroby Alzheimera nie jest jeszcze poznana, natomiast wiadomym jest, iż jest to choroba wieloczynnikowa, w leczeniu której działanie na pojedynczy cel nie wystarczy. Obecnie trwają prace nad cząsteczką łączącą w swojej strukturze grupy farmakoforowe różnych leków, a związki te nazywane są MTLDs (multi-target- directed ligands), czyli lekami wielocelowymi. Leki wielocelowe działają kompleksowo dlatego, że uwzględniają złożoność molekularnego mechanizmu choroby i dają większe szanse na wyleczenie pacjenta oraz powstrzymanie procesu chorobowego. Dodatkowo dokładne poznanie struktury AChE pozwoliło na uzyskanie bardzo cennej wskazówki w projektowaniu inhibitorów tego enzymu – potencjalny kandydat ma możliwość związania się z AChE w dwóch miejscach aktywnych (miejscu katalitycznym oraz peryferyjnym). Leki hybrydowe, dzięki zastosowaniu odpowiedniej długości łańcucha alkilowego pomiędzy grupami farmakoforowymi, mogą wiązać się z enzymem w dwóch miejscach aktywnych enzymu. Wychodząc naprzeciw współczesnym oczekiwaniom, moim celem syntetycznym były molekuły łączące w swojej strukturze inhibitor cholinoesteraz (takryna, donepezil) oraz pochodną serotoniny (ważnego neuroprzekaźnika 5-HT; 5-hydroksytryptaminy), wykazującej działanie antydepresyjne, antyoksydacyjne, regulujące zaburzenia neuroprzekaźnictwa. Elementy budulcowe połączone zostały wiązaniem karbaminianowym, które trwalej łączy się z cholinoesterazą, niż naturalnie hydrolizowany w acetylocholinie ester. Otrzymane w ten sposób pochodne, wpisujące się w koncepcję leków wielocelowych, mogą pełnić wielorakie funkcje. Zsyntetyzowane heterodimery poddałam następnie badaniom biologicznym in vitro, w celu określenia ich aktywności pod kątem inhibicji cholinoesteraz metodą Ellmana. Metoda opiera się na kolorymetrycznym pomiarze produktu reakcji hydrolizy tioacetylocholiny (ASCh), bądź tiobutyrylocholiny (BSCh) z odczynnikiem Ellmana. W badanej próbce znajduje się ASCh/BSCh, AChE/BChE (pozyskana z krwi ludzkiej), inhibitor oraz odczynnik Ellmana. Stopień zabarwienia, zmierzony za pomocą spektroskopu UV-Vis, świadczy o stopniu zajścia hydrolizy, ta zaś o stopniu inhibicji. Wyniki badań biologicznych wyraża się za pomocą indeksu IC 50 (ang. half maximal inhibitory concentration), który określa stężenie inhibitora, powodujące 50%-ową inhibicję enzymu – AChE bądź BChE. Otrzymane związki okazały się być bardzo aktywnymi oraz selektywnymi inhibitorami, co oznacza, że są potencjalnymi farmaceutykami w terapii choroby Alzheimera. Pośród gamy otrzymanych i przebadanych biologicznie związków objętych pracą (14 nowych, nie znanych dotąd w literaturze heterodimerów) można wyróżnić zarówno selektywne inhibitory AChE jak i BChE. W większości są to jednak bardzo aktywne, selektywne inhibitory względem BChE, jest to bardzo istotne, gdyż najnowsze doniesienia naukowe sugerują, iż znacznie lepsze efekty terapeutyczne przynosi strategia ukierunkowana na hamowanie BChE, wysoka selektywność względem BChE jest zatem dużym atutem. Na podstawie szeregu badań udało się określić optymalną długość łańcucha węglowego, pełniącego funkcję linkera oraz wyłonić najbardziej aktywne heterodimery, Na uwagę zasługuje heretodimer nawet 400 razy bardziej aktywny niż takryna, którego wartość IC 50 wyrażana jest w dziesiątej części nM., związek 2600 razy bardziej aktywny niż donepezil oraz najbardziej aktywny względem BChE inhibitor, którego wartość IC 50 wynosi 0,24 nM, czyli 240 pM. Wynik ten należy zaliczyć do jednych z najlepszych, jakie zostały dotąd opisane w literaturze dla inhibitorów butyrylocholinoesterazy. Heterodimery które okazały się być bardzo aktywne, zostały zatem objęte ochroną patentową, numer zgłoszenia to PCT/PL2012/000038.

The aim of my research was to synthesize new hybrid cholinesterase inhibitors, which combine different heterocyclic fragments - tacrine or donepezil (today’s pharmaceutics in Alzheimer disease, cholinesterase inhibitors) and serotonin (5-hydroxytryptamine 5-THA, neurotransmitter) which should act in the hybrid molecule as a regulator of neurotransmission, antioxidant and antidepressant, linked by the carbamate bond (which proved essential for bioactivity). Wide range of synthesized compounds differ in the length of the carbon chain and in a kind and location of substituents. The last step was to evaluate in vitro the biological activity of the novel heterodimers toward cholinesterase inhibition using Ellman’s method. Design of new inhibitors of cholinesterases is a very important part of drug discovery for Alzheimer's disease (AD). The etiology of the disease is not yet fully understood, but it is known that AD has multifactorial origin and it’s not surprising that the current drug design paradigm of one-drug-one-target may not be a sufficient model to develop treatment regiments for AD. Medicinal research is constantly seeking for improvement of the efficiency of drugs. The newest strategy is to combine in one molecule pharmacophores of different drugs in the same structure to afford hybrid molecules. The MTLDs (multi-target-directed ligands), hybrid drugs incorporate two drug pharmacophores in one single molecule with the intention to exert dual drug action. After coupling, the molecule acquires better properties. For example, the inhibitor’s activity increases (synergic effect) and it can connect with different parts of the enzyme (peripheral and active binding sites). Thus obtained derivatives may serve multiple functions, not only inhibiting the progression of the disease, but also targeting other symptoms. Synthesized hybrids show that such coupling results in higher biological activity. Several compounds were proven highly active and selective inhibitors of cholinoesterases. Those compounds are covered by a pending patent and constitute an invention reported to the Patent Office of RP - Pat. Appl. No. PCT/PL2012/000038. The study of biological activity were measured in cooperation with Medical Centre of Postgraduate Education in Warsaw. Analysis is performed according to the Ellman method. This method of evaluation of the activity of cholinesterase inhibitors is based on the fact that AChE/BChE interacts with the inhibitor, thus preventing the acetyl/ butyrylcholine hydrolysis. The inhibitor diminishes the enzyme activity which is dependent on the inhibitor concentration. The enzyme unbound to the inhibitor is still able to hydrolyze acetyl/butyrylthiocholine (ASCh/BSCh). The amount of the hydrolyzed ASCh/BSCh is measured indirectly, by quantification of the product of its reaction with DTNB (5,5′-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid). Ellman’s method relies therefore on the spectrophotometric quantification of the product of the reaction between acylthiocholine and DTNB. Samples of AChE and BChE were derived from human whole red blood cells and plasma, respectively, according to the known procedure. The enzyme activity at each concentration of the tested compound was expressed as a percent of the activity in the absence of the compound and plotted as a function of its log concentration. The inhibitory activity was calculated as IC50 value. IC50 value corresponds to the inhibitor concentration which causes a 50% decrease in the enzyme activity. The collected data are very promising and interesting, new compounds are more selective inhibitors of BChE, which is particularly important, since high selectivity toward BChE is a demanded value nowadays. Obtained hybrids are even 2600 times more active than donepezil and even 400 times more active than tacrine.