Fluorofosforowane analogi (oligo) nukleotydów jako narzędzia do badań procesów biologicznych

Sondy molekularne są cennymi narzędziami badawczymi wykorzystywanymi w badaniach biofizycznych i biochemicznych. Sondy te pozwalają badaczom na zrozumienie funkcjonowania procesów przebiegających w komórkach takich jak przekształcenia enzymatyczne, oddziaływania międzycząsteczkowe czy zmiany strukturalne w obrębie bardziej złożonych molekuł jak na przykład białka oraz kwasy nukleinowe. Celem niniejszego projektu doktorskiego było stworzenie nukleotydowych i oligonukleotydowych narzędzi molekularnych do badania procesów biologicznych związanych ze zmianami strukturalnymi oligonukleotydów oraz funkcjonowaniem enzymów. Wybraną modyfikacją chemiczną był atom fluoru, który wprowadzono w obręb struktury (oligo)nukleotydów w postaci ugrupowania fluorofosforanowego. Fluor nie występuje w naturalnych związkach organicznych, jednak jego obecność znacząco zmienia właściwości fizykochemiczne molekuł, dlatego niemal 20% wszystkich terapeutyków posiada w swojej strukturze ten atom. Co więcej, fluor jest jądrem wykazującym zjawisko magnetycznego rezonansu jądrowego, a związki znakowane fluorem znajdują zastosowanie jako sondy molekularne w monitorowaniu procesów biologicznych metodą 19F NMR. W ramach realizacji projektu doktorskiego opracowałem metodę syntezy chemicznej nukleotydów oraz oligonukleotydów znakowanych fluorofosforanem w pozycji 5’ rybozy. Następnie badałem możliwość wykorzystania tego typu związków w badaniach biofizycznych i biochemicznych, m.in. do monitorowania aktywności enzymatycznej białek, poszukiwania inhibitorów enzymów oraz śledzenia zmian konformacyjnych DNA i oddziaływań kwasów nukleinowych z białkami i małymi ligandami. Otrzymałem szereg fluorowanych oligonukleotydów, które różniły się między sobą długością (od 6 do 24 nukleotydów) oraz rodzajem zasad azotowych. Dużą uwagę poświęciłem ich zastosowaniom jako sond molekularnych w badaniach 19F NMR. Zmiany przesunięć chemicznych sygnałów na widmach NMR umożliwiły monitorowanie takich procesów biologicznych jak tworzenie dupleksów, G-kwadrupleksów oraz struktur i-motywów DNA. Ponadto okazało się, że modyfikowane fluorofosforanem oligonukleotydy umożliwiają rozróżnianie niekomplementarności nukleotydowych w dupleksach DNA oraz umożliwiają obserwację oddziaływań pomiędzy kwasami nukleinowymi a białkiem czy małocząsteczkowym ligandem. Wykazałem także użyteczność zaprojektowanych sond do badań zmian konformacyjnych oligonukleotydów zależnych od pH czy temperatury. Dodatkowym celem projektu doktorskiego było wykorzystanie małocząsteczkowych fluorofosforanowych analogów nukleotydów do badania specyficzności substratowej i poszukiwania inhibitorów pirofosfataz, DcpS oraz Fhit. Fluorofosforanowe analogi nukleotydów okazały się substratami dla wyżej wymienionych enzymów, przy czym jednym z produktów reakcji hydrolizy były jony fluorkowe. Odkrycie to umożliwiło opracowanie wysokoprzepustowej metody przesiewowej (HTS) opartej o detekcję fluorków. Opracowaną metodą HTS przeszukałem bibliotekę 141 związków pochodzenia nukleotydowego, wyselekcjonowałem najlepsze inhibitory oraz wyznaczyłem dla nich wartości parametru IC50.

Molecular probes are valuable research tools used in biophysical studies. These probes allow researchers to understand how cellular processes work, from enzymatic transformations to intermolecular interactions, and to study structural changes in more complex structures such as proteins and nucleic acids. The aim of the PhD project was to produce nucleotide and oligonucleotide biophysical tools to study biological processes related to structural changes of oligonucleotides and enzyme functions. The chosen chemical modification was a fluorine atom, which was introduced within the (oligo)nucleotide structure as the fluorophosphate moiety. Fluorine is not found in natural organic compounds, but its presence significantly alters the physicochemical properties of synthesized molecules, so nearly 20% of all therapeutics posses this atom in their structure. Moreover, fluorine is active in nuclear magnetic resonance spectroscopy, hence fluorine-labeled compounds are used as molecular probes in 19F NMR monitoring of biological processes. In this PhD project the chemical synthesis of nucleotides and oligonucleotides labeled with fluorophosphate at the 5' ribose position was developed. A number of fluorinated oligonucleotides, which differed in the length of the polymer chain (from 6 to 24) and the type of nucleobases were obtained. Much attention has been devoted to their applications as molecular probes in the 19F NMR. Signal changes on NMR spectra allowed to monitor such biological processes as formation of duplexes, G-quadruplexes and i-motif structures of DNA. Moreover, nucleotide single mismatches in DNA duplexes were distinguished and interactions between nucleic acids and protein or small-molecule ligand were monitored. The utility of the designed probes to study structural changes of oligonucleotides as a function of variations in acid-base conditions or temperature was also demonstrated. The PhD project also consists of a section devoted to the search for inhibitors of DcpS and Fhit proteins. Fluorophosphate analogs of nucleotides turned out to be substrates for the both enzymes, where fluoride ions were one of the products. This discovery enabled the development of a high-throughput screening (HTS) method based on fluorescence detection of fluorides. Using the developed HTS assay, a library of 141 nucleotide-derived compounds was searched, the best inhibitors were selected and their IC50 parameters were determined.