Zastosowanie apigeniny jako modulatora procesu mineralizacji zachodzącego w pęcherzykach macierzy pozakomórkowej wydzielanych przez komórki kości człowieka

Osteoblasty będące komórkami kompetentnymi w procesie mineralizacji kości biorą udział w początkowych etapach tego procesu. Uwalniają pęcherzyki macierzy pozakomórkowej (MV), gromadzące jony wapnia i nieorganiczny fosforan (Pi), tworząc optymalne środowisko do wytwarzania minerału – hydroksyapatytu (HA). Mineralizacja prowadzona przez MV jest złożonym procesem wymagającym zaangażowania różnych białek, takich jak aneksyny (Anx), czy tkankowo-niespecyficzna fosfataza alkaliczna (TNAP), a także związków niskocząsteczkowych. W ostatnich latach pojawiły się badania sugerujące wpływ flawonoidów na metabolizm kości. Określono, że mogą one wpływać na aktywność enzymów uczestniczących w procesie mineralizacji, oddziaływać na sygnalizację komórkową poprzez interakcje z receptorami na powierzchni komórek lub białkami macierzy pozakomórkowej (ECM), a także reagować z czynnikami transkrypcyjnymi, powodując zmiany w ekspresji genów. Wśród doniesień literaturowych znajdują się także te dotyczące apigeniny, jednego z flawonoidów, jednak istnieją wątpliwości odnoszące się do mechanizmu jej działania w warunkach fizjologicznych i patologicznych mineralizacji. Celem niniejszej rozprawy było zbadanie wpływu apigeniny na proces mineralizacji zachodzący przy udziale aneksyny A6 (AnxA6) i TNAP. W badaniach wykorzystano dwie linie kompetentnych w mineralizacji komórek kostnych człowieka: osteoblasty płodu hFOB 1.19 i komórki kostniaka kościopochodnego (osteosarkomy) Saos-2, reprezentujące odpowiednio fizjologiczną i patologiczną mineralizację. Komórki hodowano przez 7 lub 14 dni w warunkach spoczynkowych (R) lub po stymulacji kwasem askorbinowym (AA) i β-glicerofosforanem (β-GP) oraz w obecności różnych stężeń apigeniny. Wykonano eksperymenty łączące w sobie elementy chemii analitycznej z biochemią komórki. W pierwszej części badań porównano morfologię komórek, ich zdolność do mineralizacji, skład wytworzonych minerałów, zawartość białek oraz ich rozmieszczenie w komórkach i pęcherzykach. Kompetencje mineralizacyjne komórek określono poprzez barwienie minerałów czerwienią alizaryny S (AR-S) i obserwację pod mikroskopem świetlnym, a następnie ich odbarwianie chlorkiem cetylpirydyny (CPC) w celu analizy ilościowej oraz oznaczenie aktywności TNAP za pomocą testu ELISA. Apigenina wykazała zdolność do zmian struktury minerałów oraz regulacji aktywności TNAP w zależności od stężenia. Zaobserwowano przede wszystkim zwiększenie ilości wytworzonych minerałów przez komórki Saos-2. Na podstawie analizy z wykorzystaniem transmisyjnego mikroskopu elektronowego z mikroanalizą rentgenowską (TEM-EDX) stwierdzono, że apigenina może wpływać także na skład minerałów. Co więcej, badania przeprowadzone z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej ze znakowaniem nanocząstkami złota koloidalnego (nanoTEM) wykazały, że ten związek może zaburzać rozmieszczenie AnxA6 i TNAP odpowiednio w komórkach i pęcherzykach, przede wszystkim blokując agregację AnxA6 i przyłączenie TNAP do błony. W drugiej części badań wykonano eksperymenty z zastosowaniem liposomów (LUV) i proteoliposomów z wbudowaną AnxA6 (LUV-AnxA6). Analizy AR-S/CPC oraz określenie aktywności TNAP potwierdziły wyniki otrzymane dla komórek hodowanych bez dodatku LUV i LUV-AnxA6, przede wszystkim linii Saos-2. W przypadku komórek hFOB 1.19 w obecności LUV i LUV-AnxA6 zaobserwowano jednak wzrost zdolności apigeniny do stymulacji mineralizacji, który był zależny od stężenia i nie występował w przypadku hodowli bez dodatku liposomów i proteoliposomów. Co więcej, sam dodatek LUV-AnxA6 do hodowli komórek kostnych spowodował istotny wzrost ilości wytworzonych minerałów. Podsumowując, apigenina może modulować proces mineralizacji zachodzący przy udziale aneksyny A6 i TNAP, a jej działanie jest odmienne w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Co więcej, opublikowana praca [1], zawierająca wyniki z niniejszej rozprawy doktorskiej jest jedną z nielicznych wykazujących oddziaływanie tego flawonoidu na białko z rodziny aneksyn i prawdopodobnie jedyną pokazującą jak to oddziaływanie może wpływać na mineralizację. Dodatkowo, otrzymane wyniki mogą przyczynić się do zrozumienia mechanizmów biorących udział w wytwarzaniu minerałów, przede wszystkim znaczenia kompleksów AnxA6 i TNAP, a także możliwości zastosowania apigeniny jako modulatora tego procesu. Przeprowadzone badania mogą więc pomóc w opracowaniu nowych terapii w leczeniu zaburzeń mineralizacji i związanych z nimi schorzeń, co więcej nie tylko w tkankach kostnych, ale też w innych tkankach miękkich organizmu.

Osteoblasts as the bone mineralization-competent cells participate in the initial steps of mineralization process. They release matrix vesicles (MVs), accumulating calcium ions and inorganic phosphate (Pi), creating an optimal environment for the formation of mineral - hydroxyapatite (HA). Mineralization carried out by MVs is a complex process requiring the involvement of various proteins, such as annexins (Anx) or tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP), as well as low molecular weight compounds. In recent years, there have been studies suggesting the effects of flavonoids on bone metabolism. It has been determined that they can affect the activity of enzymes involved in the mineralization process, as well as cell signaling through interaction with cell-surface receptors or extracellular matrix (ECM) proteins and react with transcription factors causing changes in gene expression. Among the literature reports there are also those concerning apigenin, one of the flavonoids, but there are doubts about the mechanism of its action in physiological and pathological conditions of mineralization. As a goal of this dissertation, an analysis of the influence of apigenin on the mineralization process involving annexin A6 (AnxA6) and TNAP was carried out. For this purpose, two mineralization-competent human cell lines were used: fetal osteoblastic hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2, representing physiological and pathological mineralization, respectively. Cells were cultured for 7 or 14 days under resting conditions (R) or after stimulation with ascorbic acid (AA) and β-glycerophosphate (β-GP) and in the presence of various concentrations of apigenin. Experiments combining elements of analytical chemistry with cell biochemistry were carried out. In the first part of the research, the morphology of cells, their ability to mineralize, the composition of minerals, the proteins content and their distribution in cells and vesicles were compared. Mineralization competence of cells was determined by staining with alizarin red S (AR S) of minerals and observation under a light microscope, and then destaining with cetylpyridinium chloride (CPC) for quantitative analysis and determining the TNAP activity by ELISA assay. Apigenin showed the ability to change the mineral structure and regulate the TNAP activity depending on the concentration. First of all, an increase in the number of minerals produced by Saos-2 cells was observed. Based on analysis using a transmission electron microscope with X-ray microanalysis (TEM-EDX), it was found that apigenin influenced the mineral composition. Moreover, studies carried out using fluorescence microscopy and transmission electron microscopy with colloidal gold nanoparticles labeling (nanoTEM) showed that this compound disturbed the distribution of AnxA6 and TNAP in cells and vesicles, especially blocking AnxA6 aggregation and TNAP attachment to the membrane. In the second part of the research, experiments were performed using liposomes (LUV) and proteoliposomes with AnxA6 (LUV-AnxA6). AR-S/CPC analyzes and determination of TNAP activity confirmed the results obtained for cells cultured without the addition of LUV and LUV-AnxA6, mainly for the Saos-2 cell line. However, in the case of hFOB 1.19 cells cultured in the presence of LUV and LUV-AnxA6, a dose-dependent increase in the apigenin ability to stimulate mineralization was observed, which was was absent in cultures without the addition of liposomes and proteoliposomes. Moreover, the addition of LUV-AnxA6 to the bone cell culture resulted in a significant increase in the number of minerals compared to the control. In summary, apigenin modulates the mineralization process mediated by annexin A6 and TNAP, and its effect is different under physiological and pathological conditions. Moreover, the published paper [1], containing the results of this dissertation, is one of the few works showing this flavonoid influence on a protein from the annexin family, and probably the only one showing how this interaction can affect mineralization. In addition, the obtained results may contribute to the understanding of the mechanisms involved in the mineral formation, especially the importance of AnxA6 and TNAP complexes, as well as the possibility of using apigenin as a modulator of this process. The research carried out as part of the dissertation may also help to develop novel therapies in the treatment of mineralization disorders and related diseases, what is more, not only in bone tissues, but also in other soft tissues of the organism.