Zastosowanie banku asferycznych pseudoatomów w badaniach oddziaływań elektrostatycznych palców cynkowych z DNA

Moja rozprawa doktorska dotyczy elektrostatycznego aspektu oddziaływań pomiędzy domenami palców cynkowych a rozpoznawanymi przez nie sekwencjami DNA. Wybór modelu biologicznego podyktowany był znaczeniem poprawnego rozpoznawania konkretnych sekwencji DNA, dzięki czemu możliwa jest precyzyjna edycja genomów. Jedną z metod stosowanych do przecinania nici DNA w zdefiniowanym miejscu (tak zwanych „molekularnych nożyczek”) są białka fuzyjne, w skład których wchodzi kilka domen palców cynkowych połączonych z domeną nukleazową Fok1. Wybór narzędzia do przeprowadzenia badań podyktowany był faktem, że właśnie oddziaływania elektrostatyczne mają decydujący wpływ na oddziaływania pomiędzy makrocząsteczkami. W związku z tym zdecydowałam się na wykonanie obliczeń energii oddziaływań elektrostatycznych przy użyciu banku asferycznych pseudoatomów UBDB (ang. University of Bufallo Databank). Jest to metoda hybrydowa, która z jednej strony łączy szybkość potrzebną do przeprowadzania obliczeń dla makrocząsteczek. Natomiast z drugiej strony dostarcza wyników o dużej dokładności. Związane jest to z wysoką jakością danych wejściowych, które pochodzącą z bazy UBDB. Dzięki temu możliwe jest odtworzenie rozkładu gęstości elektronowej dla badanych układów. Prezentowane obliczenia wykonane zostały na podstawie trójwymiarowych struktur zdeponowanych w bazie struktur białkowych PDB. W trakcie przeprowadzonych badań uzyskałam następujące wyniki: (a) Poszerzyłam bank UBDB o sześć nowych typów atomowych: jeden dla atomu cynku, jeden dla atomu azotu, jeden dla atomu siarki oraz trzy dla atomów węgla, które połączone są ze wspomnianymi atomami azotu i siarki. (b) Potwierdziłam występowanie modelu kanonicznego i wykonałam ilościowy opis oddziaływań dla pierwszej serii struktur, a następnie wysunęłam hipotezę, że nawet na podstawie ograniczonych danych można zaproponować kombinacje kluczowych reszt aminokwasowych i rozpoznawanych przez nie zasad nukleotydowych, które silnie ze sobą oddziałują. Punktem wyjściowym była analiza wykonana dla dziewięciu różnych kombinacji kluczowych reszt aminokwasowych i rozpoznawanych przez nie sekwencji czterech zasad nukleotydowych. Zauważyłam wtedy, że wartość energii oddziaływania elektrostatycznego w większości przypadków powtarza się dla konkretnej pary reszta aminokwasowa – zasada, czyli jest przenoszalna niezależnie od sąsiedztwa innych reszt aminokwasowych i innych zasad azotowych. W celu weryfikacji opisanej wyżej hipotezy porównałam energię oddziaływania elektrostatycznego przewidzianą dla jednej z zaproponowanych kombinacji reszt aminokwasowych i rozpoznawanych zasad nukleotydowych z wynikiem obliczeń otrzymanym dla kompleksu, którego współrzędne przestrzenne zdeponowane zostały w bazie PDB. Zachęcona otrzymanymi wynikami postanowiłam przeprowadzić dalsze obliczenia. (c) Obliczyłam energię oddziaływania elektrostatycznego dla poszerzonego zbioru struktur oraz przedstawiłam dokładną charakterystykę analizowanych oddziaływań elektrostatycznych. Spośród struktur dla których wykonane zostały obliczenia, wyłoniłam 33 unikalne kombinacje kluczowych reszt aminokwasowych i rozpoznawanej przez nie sekwencji DNA. Następnie policzyłam sumę energii oddziaływań elektrostatycznych dla każdej z przeanalizowanych kombinacji kluczowych reszt aminokwasowych i zasad nukleotydowych z nici głównej i komplementarnej. Pozwoliło to wysnuć kolejną hipotezę dotyczącą pożądanej średniej energii oddziaływania elektrostatycznego dla projektowanych palców cynkowych, która powinna wynosić około -80 kcal/mol. Uzyskane wyniki mają duży potencjał do wykorzystania w praktyce, który należałoby zweryfikować eksperymentalnie. W przypadku potwierdzenia wartości predykcyjnej prezentowanej metodologii, spodziewane jest znaczące usprawnienie procesu projektowania nukleaz palców cynkowych precyzyjnie rozpoznających zadaną sekwencje DNA.

As electrostatic interactions are the driving force for interactions between charged macromolecules, in the current study my attention was focused on the electrostatic energy of interactions between zinc fingers and DNA. The innovative and highly accurate tool was applied, which is an aspherical pseudoatom University at Buffalo Databank (UBDB). The databank allows for a rapid reconstruction of the electron density distribution in macromolecules, as well as for quantitative analysis of macromolecular electrostatic properties. Such an approach is much more detailed than point charge force fields as it includes asphericity of electron density related to the presence of bonds and lone electron pairs. It gives an advantage not only in comparison to molecular mechanics (due to its excessive simplification) but also to the quantum-mechanical methods which are size limited. A biological model was chosen due to the importance of designing of novel proteins, which are further used for genome targeting. A correct recognition of specific DNA sequences makes possible the precise genome edition. Zinc finger nucleases (i.e. several zinc finger domains connected with the Fok1 nuclease domain) are one of the methods used to cut the DNA strand in a defined place. One can describe this as "molecular scissors". The fact that zinc finger nucleases have a huge potential in biotechnology and medicine showed the prestigious Nature Methods journal which described their role as a method of year 2011. Therefore, a deeper understanding of DNA recognition by zinc fingers is worth further investigation. At the beginning of the project, I extended the UBDB with a set of new atom types: one for the zinc atom, one for the nitrogen atom, one for the sulphur atom and three for carbon atoms that are connected to aforementioned nitrogen and sulphur atoms. Then, the electrostatic energy calculations were done on the basis of experimentally obtained geometry of several zinc finger – DNA complexes which are deposited in the Protein Data Bank (PDB). The next step was the analysis performed for nine different combinations of key aminoacid residues (belonging to the zinc finger domain) and four nucleobases they recognize (short DNA sequence). I noticed that the energy of electrostatic interaction in most cases is very similar for a specific pair of aminoacid residue and nucleobase, i.e. it is transferable regardless of the proximity of other aminoacid residues and other nucleobases. Based on this observation, I have proposed some combinations of aminoacid residues and recognized by them nucleobases. After that, I compared the predicted energy of electrostatic interaction with the results of calculations obtained for one structure which spatial coordinates were deposited in PDB. The structure contained the predicted key aminoacids and nucleobases. Encouraged by obtained results, I decided to carry out further calculations. For extended set of structures, I described all observed electrostatic interactions. Moreover, I calculated the sum of electrostatic energy for each of the analysed combinations of the key amino acid residues and nucleobases from the main and complementary DNA strands. This led me to another hypothesis about the desired average electrostatic energy for the designed zinc fingers which should be around -80 kcal/mol. The obtained results have great potential for practical use, which/that should be verified experimentally. If the predictive power of the presented methodology is confirmed, the significant improvement for designing zinc finger nucleases that accurately recognize the a given DNA sequence is expected.