Planarne membrany lipidowe unieruchomione na powierzchni elektrod: projektowanie i właściwości układów biomimetycznych umożliwiających rekonstytucję kanałów jonowych

Celem niniejszej pracy było skonstruowanie i scharakteryzowanie trzech układów naśladujących swoją budową i właściwościami błony komórkowe. Ponadto, rekonstytuowano w nich białka transmembranowe i zbadano wpływ tych białek na właściwości membrany. Błona komórkowa stanowi istotny element budowy komórki. Składa się z lipidów, tworzących dwuwarstwę, w której to zakotwiczone są białka. W zależności od lokalizacji możemy wyróżnić białka powierzchniowe oraz transmembranowe, przy czym do tych ostatnich należą tzw. kanały jonowe. Ogromna ilość białek zintegrowanych z membraną nie została do końca zbadana. Nie znamy ich właściwości oraz nie poznaliśmy ich funkcjonalności. Niestety skomplikowana matryca w postaci fragmentów błony komórkowej utrudnia scharakteryzowanie pojedynczych białek. Dlatego też istnieje potrzeba konstruowania biomimetyków błon komórkowych umożliwiających pełną i funkcjonalną rekonstytucję białek tak, aby stworzyć odpowiednie warunki badania ich w warunkach zbliżonych do natywnych. Pierwszy utworzony i scharakteryzowany układ przedstawiał model błony komórkowej komórki eukariotycznej. W tym celu wykorzystano model kotwiczącej dwuwarstwy lipidowej na której, wykorzystując fuzję liposomów, odtworzono membranę lipidową przypominającą skład błony komórki eukariotycznej. Następnie zbadano wpływ toksyny - alfa hemolizyny na modelowy układ błony komórkowej. Wykazano, że toksyna w obecności tak odtworzonego układu przejawia właściwości zbliżone do tych obserwowanych w naturze. W obydwu przypadkach toksyna ta powoduje powstanie kanału jonowego w membranie, co skutkuje wypływem wody z rejonu submembranowego (w naturze jest to cytozol). Ponadto, zaobserwowano przesunięcie potencjału zerowego ładunku w stosunku do samej membrany. Można tu znaleźć analogię do depolaryzacji membrany, która zachodzi w warunkach naturalnych. Przedstawiony układ może z powodzeniem zostać użyty do wstępnej weryfikacji związków, które hamowałyby interakcję tego białka z membraną, jak również jako biosensor. Drugi układ był analogiczny do powyższego. Różnica tkwiła w użytym prekursorze do odtworzenia membrany lipidowej. W tym przypadku wykorzystano bicele. Pierwotnie, prekursory te były wykorzystywane do badań białek transmembranowych za pomocą metod NMR z zachowaniem ich natywnej struktury. W kolejnym kroku tutaj również zbadano efekt wyżej wspomnianej toksyny na modelowy układ. Otrzymane przeze mnie wyniki są analogiczne do tych uzyskanych dla układu z odtworzona membraną za pomocą liposomów, dlatego też, można wykorzystać je w ten sam sposób co liposomy. Otwiera to szerokie możliwości do badań innych białek transmembranowych, które nie są zdolne do spontanicznej integracji z membraną, bądź odtworzenie ich w proteoliposomach jest dość problematyczne. Ostatni model odzwierciedlał swoją budową błonę komórkową bakterii E. Coli. Skonstruowano go poprzez rozłożenie na elektrodzie liposomów. Następnie właściwości membrany porównano do zbliżonego układu, tylko z wbudowanym mechanoczułym kanałem jonowym o dużej przewodności. Dzięki temu mogliśmy poznać i zrozumieć jak wybrany kanał wpływa na właściwości membrany E. Coli pod wpływem zewnętrznego napięcia / bodźca. Zauważyłem, że jest on zdolny do zmiany swojej średnicy pod wpływem przyłożonego zewnętrznego pola elektrycznego. Bodziec ten powoduje reorientację helikalnych fragmentów białka. Odkrycie to może pomóc w poszukiwaniu nowych leków z grupy antybiotyków, które hamowałyby działanie białka lub wymuszały jego otwarcie prowadząc do niekontrolowanego przepływu jonów. Ponadto, układ ten może z powodzeniem zostać wykorzystany jako nośnik leku, gdzie za pomocą zmiany polaryzacji nośnika możliwe byłoby otwarcie go i uwolnienie leku.

The aim of this study was to construct and characterize three systems imitating the structure and properties of cell membranes. Moreover, the transmembrane proteins were reconstituted therein and the influence of these proteins on the properties of the membrane was investigated. Cell membranes are found in all types of cells and separate the interior of the cell from the outside environment. They consist of lipids forming a bilayer in which proteins are anchored. Depending on the location, we can distinguish surface and transmembrane proteins, the latter being so-called ion channels. A large amount of proteins integrated into the membrane has not been fully studied yet. We do not know their properties and we do not know their functionality. Unfortunately, the complex matrix of fragments of the cell membrane makes it difficult to characterize individual proteins. Therefore, there is a need to design biomimetics of cell membranes that would enable a complete and functional reconstitution of proteins in order to study the proteins in conditions similar to native ones. The first created and characterized system was a model of a eukaryotic cell membrane. For this purpose, the model of Sparsely Tethered Bilayer Lipid Membranes (stBLM) was used. The membrane was obtained by spreading lipid vesicles, whose composition resembled that of the eukaryotic cell membrane. Then, the influence of the toxin – alpha-hemolysin on the model of the cell membrane system was investigated. It has been shown that the toxin in the presence of such a reconstructed system exhibits properties similar to those observed in nature. In both cases, this toxin created an ion channel in the membrane, which resulted in the outflow of water from the submembrane region (which in nature is a cytosol). Moreover, a shift in the potential of the zero free charge was observed in the membrane. An analogy can be found here with the depolarization of the membrane, which manifests itself naturally. The presented system can be successfully used for the initial verification of compounds that would inhibit the interaction of alpha-hemolysin with the membrane, as well as for the construction of a biosensor. The second system was analogous to the model mentioned above. However, the difference consisted in the precursor used to reconstruct the lipid membrane, which now employed bicelles instead of lipid vesicles. Originally, bicelle-based models were used to study transmembrane proteins using NMR methods while maintaining their native structure. In the next step, the effect of the alpha-hemolysin on the biomimetic membrane formed by bicelles was also examined. The obtained results are analogous to those obtained for the system with the membrane formed by liposomes. Therefore, bicelles constitute a good alternative to liposomes. This opens up wide range of possibilities for the studies of other transmembrane proteins which are not capable of spontaneous integration into the membrane, or their reconstruction in proteoliposomes is rather problematic. The last model reflected the composition of the cell membrane of E. Coli bacteria and was constructed by spreading liposomes on the electrode. The changes in the properties of such a model membrane upon the insertion of a large-conductance mechanosensitive channel were also investigated. Such an approach helped to understand how the selected channel affects the properties of the E. Coli membrane under the influence of external tension/stimulus. It has been found that the channel formed by the protein is able to change its diameter under the influence of an applied external electric field causing the reorientation of the helical fragments of the protein. This discovery could be of particular importance for the search for new antibiotic drugs which would inhibit the action of proteins or force them to open, leading to an uncontrolled flow of ions. Moreover, this system can be successfully used as a drug carrier, whereby by changing the polarity of the carrier it would be possible to open it and release the drug.