Badanie mechanizmów retencji związków biologicznie aktywnych w chromatografii oddziaływań hydrofilowych

Termin „chromatografia oddziaływań hydrofilowych” został po raz pierwszy użyty przez Alperta w 1990 roku w celu zdefiniowania techniki chromatograficznej, będącej połączeniem chromatografii w układzie faz odwróconych i normalnych. Wariant ten miał być szczególnie przydatny w analizie związków polarnych, które są niezatrzymywane na niepolarnych złożach i wymywane w objętości martwej (układ faz odwróconych) lub są zbyt silnie zatrzymywane przez polarne złoża (układ faz normalnych). Zastosowanie polarnych faz ruchomych i stosunkowo mało polarnych eluentów o bardzo dużej zawartości rozpuszczalników organicznych, dało początek technice szczególnie dedykowanej właśnie związkom polarnym- chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC). Pomimo, iż popularność tego wariantu chromatografii ciągle rośnie, to wciąż nie zdefiniowano dokładnego mechanizmu rozdzielania zachodzącego w HILIC. Pierwotnie postulowano podział analitu między cienką warstwę wodną zaadsorbowaną na powierzchni polarnego złoża, a znacznie bardziej niepolarny eluent. Dziś wiadomo już, że mechanizm ten jest o wiele bardziej skomplikowany i zarówno wspomniany podział jak również adsorpcja bezpośrednio na złożu kolumny wpływa na retencję analitu. W zależności od struktury analitu i formy w jakiej on występuje, oddziaływania elektrostatyczne jak również tworzenie wiązań wodorowych mogą mieć wpływ na jego retencję. W literaturze opisano szereg prób podjętych w celu zdefiniowania mechanizmu retencji w chromatografii oddziaływań hydrofilowych. Jednak autorzy tych prac zwykle stosują modelowe związki należące do różnych klas, znacznie różniące się zarówno budową jak i polarnością. Niniejsza rozprawa doktorska miała na celu zbadanie mechanizmów retencji flawonoidów, jako przedstawicieli związków biologicznie aktywnych, w chromatografii oddziaływań hydrofilowych z zastosowaniem różnego rodzaju faz stacjonarnych oraz ruchomych. W trakcie badań wykorzystano cztery fazy stacjonarne, znacznie różniące się właściwościami. Użyto, niezmodyfikowanej krzemionki (Atlantis HILIC, złoże obdarzone ładunkiem), złoża diolowego (Luna HILIC, neutralne) oraz faz sulfobetainowych (ZIC-HILIC i pZIC-HILIC, dwubiegunowe). W celu dokładniejszego opisu obserwowanych zjawisk zbadano również wpływ takich parametrów jak rodzaj użytego rozpuszczalnika organicznego i pH fazy ruchomej, wpływ stężenia soli w eluencie oraz temperaturę w jakiej prowadzono rozdzielenie na retencję flawonoidów. Opracowane optymalne metody zastosowano w analizie próbek naturalnych. The term "hydrophilic interaction chromatography" was first used by Alpert in 1990 to define a chromatographic technique, which is a combination of reversed phase and normal phase chromatography. This mode was assumed to be particularly useful in the analysis of polar compounds which are not retained on non-polar stationary phases and eluted in the dead volume (reversed phase) or were too strongly retained by the polar ones (normal phase mode). The use of polar stationary phases and relatively weak polar eluents with very high content of organic solvents, gave birth technique especially dedicated for analysis of polar compounds- hydrophilic interaction chromatography (HILIC). Although the popularity of this chromatographic mode continues to grow, the exact mechanism of separation occurring in HILIC is still not defined. Originally partition of analyte between the thin layer of water adsorbed on the polar surface of the stationary phase and less polar eluent was postulated. Today, it is already known that this mechanism is much more complicated and both partition and adsorption directly onto the stationary phase affects the retention of the analyte. Depending on the structure of the analyte and the form in which it occurs, the electrostatic interaction and hydrogen bonding may have an influence on its retention. The literature describes a number of attempts made in order to define the mechanism of retention in hydrophilic interaction chromatography. However, the authors of these works commonly use model compounds belonging to different classes, significantly different in both structure and polarity. The aim of this dissertation was to investigate the retention mechanisms of flavonoids as representatives of biologically active compounds, in hydrophilic interaction chromatography, using different types of stationary and mobile phases. In the study four stationary phases, significantly different in properties were used. Unmodified silica (Atlantis HILIC, the bed-charged), diol (Luna HILIC, neutral), and the sulphobetaine stationary phases (ZIC-HILIC and pZIC-HILIC, bipolar) were applied. For a detailed description of the observed phenomena the influence of another parameters of the separation such as the type of used organic solvent, pH of the mobile phase, the effect of the salt concentration in the eluent and the temperature at which the separation was carried out were also examined. Optimized methods were used in the analysis of natural samples.