Aromatyczne pochodne cyklodekstryn jako nośniki leków antracyklinowych

W części literaturowej niniejszej pracy przedstawiono antracykliny, ich budowę, mechanizm działania oraz zastosowanie w terapiach antynowotworowych. Opisano udział antracyklin w reakcjach prowadzących do tworzenia reaktywnych form tlenu, a także pokazano ich toksyczny wpływ na organizm. Scharakteryzowano cyklodekstryny, ich budowę oraz zastosowania w nośnikach leków. W części eksperymentalnej opisano techniki pomiarowe stosowane w pracy oraz przedstawiono szereg modyfikowanych β-cyklodekstryn, zawierających w strukturze pierścień aromatyczny połączony z pierścieniem oligocukru trzema różnymi łącznikami: mostkiem siarczkowym, pierścieniem triazolowym i wiązaniem hydrazonowym. Wyznaczono rozpuszczalności wszystkich pochodnych β-cyklodekstryny w wodzie przy użyciu techniki spektrofotometrycznej. Wykazano, że rozpuszczalność β-cyklodekstryn jest uzależniona nie tylko od podstawnika w pierścieniu aromatycznym, ale także od rodzaju użytego łącznika. β-cyklodekstryny z łącznikiem siarkowym wykazują najniższą rozpuszczalność w rozpuszczalnikach wodnych (około stukrotnie niższą, niż rozpuszczalność w wodzie natywnej β-cyklodekstryny) i wymagają znacznego dodatku rozpuszczalników aprotycznych, co częściowo dyskwalifikuje ten rodzaj pochodnych w zastosowaniach medycznych. Cyklodekstryny modyfikowane pierścieniem triazolowym charakteryzują się rozpuszczalnością 10-krotnie wyższą niż pochodne siarkowe, natomiast rozpuszczalność β-cyklodekstryn z łącznikiem hydrazonowym jest zbliżona do rozpuszczalności natywnej β-cyklodekstryny. Zmiana podstawnika w pierścieniu aromatycznym powoduje wzrost rozpuszczalności β-cyklodekstryn w szeregu: fenylowy, krezolowy, metoksylowy. Wykorzystując metodę woltamperometrii cyklicznej wyznaczono stałe trwałości kompleksów cyklodekstryn z doksorubicyną. Wykazano, że modyfikacja β-cyklodekstryn grupami zdolnymi do tworzenia oddziaływań π-π z pierścieniem doksorubicyny, powoduje wzrost stałej trwałości kompleksu cyklodekstryny z doksorubicyną nawet o 2-3 rzędy wielkości. Zapobiega to konkurencyjnej reakcji kompleksowania leku z DNA i wymianie skompleksowanej przez β-cyklodekstrynę antracykliny na inne molekuły znajdujące się w krwiobiegu. Wykazano, że stała trwałości kompleksu, jaki tworzy doksorubicyna z cyklodekstryną może być z powodzeniem zmieniana poprzez użycie innej pochodnej cyklodekstryny. Cyklodekstryny z łącznikiem siarkowym tworzą kompleksy o najwyższej stałej trwałości, o trzy rzędy wielkości wyższe, natomiast cyklodekstryny z łącznikiem triazolowym oraz hydrazonowym wykazują stałe trwałości o 2 rzędy wielkości wyższe, od stałych kompleksu z natywną β-cyklodekstryną. Stała trwałości kompleksu może być także modyfikowana poprzez użycie różnej długości łącznika węglowodorowego. β-cyklodekstryny z dłuższym łańcuchem węglowodorowym tworzą kompleksy z doksorubicyną o wyższej stałej trwałości niż β-cyklodekstryny z łańcuchem krótszym o grupę -CH2-. Jest to spowodowane występowaniem naprężeń sterycznych w podstawnikach z krótszym łańcuchem. W przypadku zmiany podstawnika w pierścieniu aromatycznym, obserwowano także zmianę stałej trwałości kompleksu, przy czym podstawniki dostarczające gęstości elektronowej do pierścienia aromatycznego (metoksylowy i metylowy) tworzyły silniejsze kompleksy inkluzyjne z doksorubicyną, w porównaniu z pochodnymi pozbawionymi tych podstawników. Kontrola stałej trwałości kompleksu jest szczególnie istotna w przypadku nośników leków i pozwala na dobranie optymalnej pochodnej β-cyklodekstryny do warunków podawania leku. Pozwala również na planowanie ilości uwalnianego leku oraz czasu jego uwalniania. W dalszej części przedstawiono badania metodami NMR, CV, UV-Vis oraz modelowanie molekularne, które pokazują, że kompleksy modyfikowanych β-cyklodekstryn z doksorubicyną są wrażliwe na zmianę środowiska. W rozpuszczalnikach aprotycznych, takich jak DMSO lub DMF, doksorubicyna nie tworzy kompleksów inkluzyjnych z pochodnymi β-cyklodekstryny, a jedynie oddziałuje zewnętrznie z nośnikiem poprzez wiązania wodorowe. Obecność podstawnika aromatycznego w β-cyklodekstrynie prowadzi do wzrostu kwasowości protonów grup hydroksylowych oligocukru w rozpuszczalnikach aprotycznych. Podczas kontaktu doksorubicyny z tak zmienioną β-cyklodekstryną następuje rozerwanie wewnątrzcząsteczkowego wiązania wodorowego w grupie antrachinonowej doksorubicyny oraz utrata protonu z grupy hydrochinonowej. Objawia się to zmianą zabarwienia roztworu doksorubicyny z barwy pomarańczowej na niebieską. Forma ta jest szczególnie podatna na działanie promieniowania z zakresu światła widzialnego prowadząc do rozpadu leku. Ta właściwość aromatycznych pochodnych β-cyklodekstryn narzuca więc sposób przechowywania ich kompleksów z doksorubicyną. Badania elektrochemiczne oraz spektroskopowe cyklodekstryn, zawierających w swojej strukturze podstawnik aromatyczny połączony z pierścieniem oligocukru łącznikami triazolowym lub hydrazonowym wykazały, że ten rodzaj nośników sprzyja selektywnemu wiązaniu doksorubicyny we wnęce β-cyklodekstryny. Przy pH 7,4, charakterystycznym dla drogi podawania leku, nowe pochodne tworzą znacznie trwalsze kompleksy z doksorubicyną niż w pH 5,5, odpowiadającemu pH płynu okołokomórkowego guza. Właściwość ta pozwala na zastosowanie badanych pochodnych jako samodzielne nośniki leków antracyklinowych. Pierwsze badania na komórkach nowotworowych HeLa i A549 potwierdziły addytywny efekt cytotoksyczny kompleksów cyklodekstryn z doksorubicyną, świadczący o uwalnianiu się leku z nośnika w obecności komórek nowotworowych. Badania te pokazują również, że używane w niniejszej pracy cyklodekstryny wykazują małą oraz krótkotrwałą toksyczność.

In the theoretical part of the work on anthracycline antibiotics, their structure and applications in anticancer therapies were described as well as their toxic effects resulting from the generation of reactive oxygen species. Cyclodextrins structures and their utility as drug delivery systems were characterized. In the experimental section of this work, the experimental techniques were described and the series of newly synthesized cyclodextrin derivatives were shown. The cyclodextrins were modified with an aromatic ring connected with the oligosaccharide ring by means of three types of linkers: sulfur bridge, triazole ring and hydrazone bond. The solubilities of all compound, determined using UV-Vis spectroscopy, was found to depend on both the substituent located on the aromatic ring and the type of the linker. The cyclodextrins modified with aromatic groups were shown to form strong complexes with anthracycline due to proton-acceptor π-π interactions between the aromatic ring in the drug molecule and aromatic residue in the side chain of the cyclodextrin. The modifications lead to 2−3 orders of magnitude larger stability constants of the complexes with doxorubicin (DOX) than those of the native βCD. Increased stability prevented competing complexation reactions as well as replacement of the drug by other molecules found in the bloodstream. It has been also shown, that the stability constant of the cyclodextrin-doxorubicin complex can be changed by using appropriate cyclodextrin derivative. The cyclodextrin containing sulfur bridge as a linker formed strongest complexes while the complexes of cyclodextrin modified with triazole ring and hydrazone bond show ca. one order of magnitude lower stability constant of the complex with doxorubicin. The stability constants of the cyclodextrin-doxorubicin inclusion complex were demonstrated to depend on the length of hydrocarbon chain in the linker. Those with a longer hydrocarbon chain formed stronger complexes due to lower sterical stress. The substituents located on the phenyl group also affected the stabilities of the cyclodextrin-doxorubicin complexes. Cyclodextrins with more electron-rich aromatic substituents form stronger inclusion complexes with doxorubicin than cyclodextrins without these substituents. The ability to tune the stability of cyclodextrin-doxorubicin complex is particularly important in the case of drug delivery and allows to choose optimal derivatives of β-cyclodextrin for drug administration. NMR, CV, UV-Vis and molecular modeling experiments have shown that the complex formation was depends on the solvent used. The inclusion complex is obtained in the presence of water, while in aprotic solvents the complex is not formed because doxorubicin cannot compete with the side chain of CD for the place in the cavity. Voltammetric and spectroscopic studies revealed that cyclodextrin possessing the aromatic substituents connected via hydrazone bond and triazole group can be employed for pH - selective binding of DOX. While at pH 7.4, characteristic for bloodstream, the new derivatives form strong complexes with DOX, at pH 5.5, which corresponds to the fluid surrounding the tumor, the stability constants of cyclodextrin-doxorubicin complex were found to be much smaller. This property allows the use of the derivatives of cyclodextrin as independent anthracycline drug carriers. The first studies on HeLa and A549 tumor cells confirmed additive cytotoxic effect of cyclodextrin-doxorubicin complexes proving the release of the drug from the carrier in the presence of tumor cells. These studies also indicated that cyclodextrins themselves are not completely innocent – they can induce low and short-term toxicity.