Inhibitory fosforylazy nukleozydów purynowych (PNP) oraz syntetazy adenylobursztynianowej (AdSS) jako potencjalne nowe leki w eradykacji Helicobacter pylori

Helicobacter pylori to gram-ujemna, mikroaerofilna, spiralna bakteria zidentyfikowana 40 lat temu. Kolonizuje błonę śluzową żołądka oraz dwunastnicy połowy ludzkiej populacji na świecie, a jej obecność w organizmie może wywołać poważne choroby takie jak: wrzody żołądka i dwunastnicy oraz nowotwory żołądka. W 1994 roku Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) sklasyfikowała H. pylori jako czynnik rakotwórczy klasy I. Leczenie najczęściej polega na stosowaniu przez 10 do 14 dni inhibitora pompy protonowej oraz bizmutu w kombinacji z antybiotykami, zwykle klarytromycyną, amoksycyliną, lewofloksacyną czy metronidazolem. Istnieje wiele różnych schematów postępowania, jednak terapia u 20% pacjentów kończy się niepowodzeniem z powodu wzrastającej oporności na stosowane antybiotyki. W 2017 roku WHO zaliczyła szczepy H. pylori oporne na klarytromycynę do grupy priorytetowych patogenów w kategorii konieczności wprowadzenia nowych leków do terapii. Dlatego bardzo istotne jest poszukiwanie nowych celów molekularnych do zaprojektowania nowych leków do eradykacji H. pylori. H. pylori, jako patogen, który ewoluował w bliskim związku ze swoim gospodarzem, nie syntetyzuje zasad purynowych, nukleozydów i nukleotydów purynowych de novo. Natomiast pozyskuje ze środowiska zasady purynowe oraz nukleozydy purynowe, i w reakcji katalizowanej przez fosforybozylotransferazę, w której do zasad przyłączany jest 5- fosforybozylo-1-pirofosforan, generuje nukleotydy niezbędne do syntezy DNA i RNA. Metabolizm H. pylori opiera się więc jedynie na tzw. drodze zapasowej (ratunkowej) pozyskiwania puryn, jako jedynej umożliwiającej syntezę kwasów nukleinowych. Obecność w tym szlaku enzymów, fosforylazy nukleozydów purynowych (PNP) oraz syntetazy adenylobursztynianowej (AdSS), kodowanych przez geny, odpowiednio deoD i purA, jest kluczowa dla przeżycia H. pylori. Enzym PNP katalizuje odwracalną reakcję fosforolitycznego rozszczepienia wiązania glikozydowego nukleozydów purynowych na odpowiednią zasadę purynową i pentozo-1-fosforan. Natomiast enzym AdSS katalizuje reakcję powstawania adenylobursztynianu z inozynomonofosforanu oraz L-asparaginianu. Głównym celem rozprawy doktorskiej jest sprawdzenie hipotezy, czy możliwe jest całkowite zahamowanie wzrostu H. pylori, kiedy celem dla potencjalnych nowych leków będą kluczowe enzymy drogi zapasowej pozyskiwania puryn, PNP i/lub AdSS. W pierwszej części pracy przedstawiono właściwości biofizyczne oraz biochemiczne różnych wariantów enzymu AdSS pochodzącego z H. pylori - ze znacznikiem histydynowym 6xHis na N-końcu lub C-końcu oraz białka natywnego. Pokazano, że kinetyka reakcji jest dobrze opisana przez równanie Michaelisa-Menten, jednak pomiędzy wariantami występują pewne różnice w wartościach stałej Michaelisa i/lub szybkości maksymalnej. Ponadto, postać oligomeryczna i stabilność trzech wariantów enzymu zależą od obecności soli i stężenia białka w roztworze. Zidentyfikowano 5’-fosforan pirydoksalu (PLP), czyli witaminę B6, jako silny, wolno wiązany, kompetycyjny wobec GTP inhibitor enzymu i metodą dyfrakcyjną wyznaczono strukturę AdSS z H. pylori w kompleksie z PLP. W drugiej części pracy badano wpływ wielu różnych związków na aktywność enzymów PNP lub AdSS określając stałą inhibicji (Ki), a także zbadano ich wpływ na wzrost różnych szczepów H. pylori wyznaczając wartość MIC oraz MBC (odpowiednio: minimalne stężenie hamujące oraz bakteriobójcze). Wykazano, że znane wcześniej inhibitory PNP Escherichia coli, formycyna A i formycyna B, są także inhibitorami PNP H. pylori, przy czym formycyna B jest bardzo silnym inhibitorem o Ki = 0,96 ± 0,08 µM. Pokazano jednak, że żaden z tych związków nie hamuje skutecznie wzrostu bakterii. Badano także puryny podstawione w pozycji drugiej i/lub szóstej jako potencjalne inhibitory PNP z H. pylori. Najlepsze właściwości hamujące aktywność enzymu ma 6-benzyltio-2-chloropuryna. Ona także najlepiej hamuje wzrost bakterii osiągając wartości MIC, w zależności od szczepu, od kilkunastu do kilkudziesięciu µg/ml. Związki z tej grupy działają bakteriostatycznie, jedynie 2,6-dichloropuryna działa bakteriobójczo, ale dopiero w wysokim stężeniu (MBC = 236 µg/ml). Spośród badanych analogów nukleozydów purynowych, immucylina A oraz immucylina H okazały się bardzo silnymi inhibitorami PNP (wartość Ki wynosi zaledwie kilka nM), przy czym immucylina A hamuje wzrost H. pylori (MIC = 21 µg/ml), a co więcej, w połączeniu z metronidazolem działa addytywnie i bakteriobójczo. Natomiast immucylina H nie hamuje wzrostu bakterii nawet w wysokim stężeniu (85 µg/ml). Do badań wytypowano również chininę i meflochinę, które są inhibitorami PNP z Plasmodium falciparum, mikroorganizmu powodującego malarię, który także nie syntetyzuje puryn i nukleozydów purynowych de novo i wykazano, że oba związki nie hamują aktywności PNP H. pylori, ale meflochina działa bakteriobójczo na H. pylori już w stężeniach kilkunastu µg/ml, także na szczepy oporne na metronidazol i klarytromycynę. Ponadto wykazano, że spośród testowanych związków hadacydyna oraz aktywna forma witaminy B6 (5’-fosforan pirydoksalu, PLP) są bardzo dobrymi kompetycyjnymi inhibitorami AdSS H. pylori. Jednak hadacydyna nie hamuje wzrostu bakterii, a witamina B6 działa bakteriobójczo także na szczepy oporne, jednak w bardzo wysokich stężeniach rzędu kilkuset µg/ml. W ostatniej części rozprawy przedstawiono opracowaną na potrzeby tej pracy metodę badania penetracji do komórek H. pylori badanych związków. Przetestowano przede wszystkim inhibitory, które silnie hamują aktywność PNP lub AdSS, ale nie wpływają na wzrost bakterii. Mierząc stężenie zewnątrzkomórkowe inhibitora za pomocą spektrometrii mas, pomiaru absorpcji UV i/lub inhibicji enzymu docelowego pokazano, że hadacydyna oraz immucylina H nie wnikają do wnętrza komórek H. pylori, a formycyna A i formycyna B przenikają jedynie w bardzo niewielkim stopniu, co tłumaczy obserwowany brak działania antybakteryjnego tych związków. W prezentowanej pracy po raz pierwszy wykazano, że hamowanie aktywności enzymów PNP i/lub AdSS prowadzi do całkowitego zahamowania wzrostu .

Helicobacter pylori is a gram-negative, microaerophilic, spiral bacterium identified 40 years ago. It colonizes the gastric and duodenal mucosa of half of the world's human population, and it’s presence may cause serious diseases, such as stomach and duodenal ulcers and stomach cancer. In 1994, the World Health Organization (WHO) classified H. pylori as a class I carcinogen. Treatment most often involves the use of a proton pump inhibitor and bismuth for 10 to 14 days in combination with several antibiotics, usually clarithromycin, amoxicillin, levofloxacin or metronidazole. There are many different treatment regimens, but the therapy fails in 20% of patients due to increasing resistance to the antibiotics used. In 2017, WHO included clarithromycin-resistant H. pylori strains among the priority pathogens in the category of the need to introduce new drugs for therapy. Therefore, it is very important to search for new molecular targets to design new drugs enabling the eradication of H. pylori. H. pylori, as a pathogen that has evolved in close association with its host, does not synthesize purine bases, nucleosides and purine nucleotides de novo. However, it acquires purine bases and purine nucleosides from the environment, and in a reaction catalyzed by phosphoribosyltransferase, in which 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate is attached to the bases, it generates nucleotides necessary for the synthesis of DNA and RNA. Thus, the metabolism of H. pylori is based only on the so-called the purine salvage pathway, as the only one enabling the synthesis of nucleic acids. The presence of the enzymes in this pathway, purine nucleoside phosphorylase (PNP) and adenylosuccinate synthetase (AdSS), encoded by the genes deoD and purA, respectively, is crucial for the survival of H. pylori. The PNP enzyme catalyzes the reversible phosphorolytic cleavage of the glycosidic bond of purine nucleosides to get the appropriate purine base and pentose-1-phosphate. The AdSS enzyme catalyzes the synthesis of adenylosuccinate from inosine monophosphate and L-aspartate. The main goal of the doctoral dissertation is to test the hypothesis whether it is possible to completely inhibit the growth of H. pylori when the target for potential new drugs will be the key enzymes of the purine salvage pathway, PNP and/or AdSS. The first part of the work presents the biophysical and biochemical properties of various variants of the AdSS enzyme derived from H. pylori - with a 6xHis histidine tag at the N-terminus or C-terminus and the native protein. It has been shown that although the reaction kinetics is well described by the Michaelis-Menten equation, there are some differences between the variants in the values of the Michaelis constant and/or maximal velocity. Furthermore, the oligomeric form and stability of the three AdSS variants depend on the presence of salt and the protein concentration in the solution. Pyridoxal 5'-phosphate (PLP), i.e. vitamin B6, was identified as a strong, slowly bound, GTP-competitive enzyme inhibitor, and the structure of AdSS from H. pylori in complex with PLP was determined using the X ray diffraction method. In the second part of the work, the influence of various compounds on the activity of PNP or AdSS enzymes was examined by determining the inhibition constant (Ki), and their impact on the growth of various H. pylori strains was studied by determining the MIC and MBC values (minimum inhibitory concentration and bactericidal concentration, respectively). Previously known Escherichia coli PNP inhibitors, formycin A and formycin B, have been shown to also be H. pylori PNP inhibitors, with formycin B being a very potent inhibitor with Ki = 0.96 ± 0.08 µM. However, it has been shown that none of these compounds effectively inhibits bacterial growth. Purines substituted in the second and/or sixth position were also investigated as potential inhibitors of H. pylori PNP. 6-benzylthio-2-chloropurine is the best inhibitor of the enzyme. It is also the best in stopping the bacterial growth, with MIC values, depending on the strain, from a dozen to several dozen µg/ml. However, compounds from this group only have a bacteriostatic effect, except for 2,6-dichloropurine that has a bactericidal effect, but only at high concentrations (MBC = 236 µg/ml). Among the purine nucleoside analogues tested, immucillin A and immucillin H turned out to be very strong PNP inhibitors (the Ki value is only a few nM), and immucilin A inhibits the growth of H. pylori (MIC = 21 µg/ml), and what is more, in combination with metronidazole it has additive and bactericidal effects. By contrast, immucillin H has no effect on H. pylori growth even in high concentration of (85 µg/ml). Quinine and mefloquine, which are inhibitors of PNP from Plasmodium falciparum, a malaria-causing microorganism that also does not synthesize purines and purine nucleosides de novo, were also selected for testing, and it was shown that both compounds do not inhibit the activity of H. pylori PNP, but mefloquine has a bactericidal effect on H. pylori at concentrations of several µg/ml, even against strains resistant to metronidazole and clarithromycin. Moreover, it was shown that among the tested compounds, hadacidin and the active form of vitamin B6 (pyridoxal 5'-phosphate, PLP) are very good competitive inhibitors of H. pylori AdSS. However, hadacidin does not inhibit the growth of bacteria, and while vitamin B6 has a bactericidal effect on resistant strains, but at very high concentrations of several hundred µg/ml. The last part of the dissertation presents the method developed for the purpose of testing the penetration of studied compounds into H. pylori cells. Primarily, inhibitors that strongly inhibit PNP or AdSS activity but do not affect bacterial growth were tested. By measuring the extracellular concentration of the inhibitor using mass spectrometry, UV absorption and/or inhibition of the target enzyme, it was confirmed that hadacidin and immucillin H do not penetrate H. pylori cells. while formycin A and formycin B penetrate only to a very small extent. These results explain while these compounds do not have antibacterial activity. In the presented dissertation, it was shown for the first time that inhibiting the activity of PNP and/or AdSS enzymes can completely stop the growth of H. pylori. The obtained results may contribute to the design and obtain new drugs to combat H. pyloriH. pylori. Otrzymane wyniki mogą zatem zostać wykorzystane do zaprojektowania i uzyskania nowych leków do zwalczania H. pylori.