Synteza, badania powinowactwa do receptora Neuropiliny-1 oraz aktywności biologicznej nowych peptydomimetyków

Neuropilina-1 (NRP-1) jest jednym z najważniejszych receptorów naczyniowego śródbłonkowego czynnika wzrostu VEGF-A165. Pełni funkcję ko-receptora dla VEGFR, który jest głównym receptorem dla VEGF-A165. NRP-1 uczestniczy także w zwiększaniu transdukcji sygnału w komórce, ale może również działać niezależnie. NRP-1 odgrywa ważną rolę w angiogenezie, czyli procesie powstawania nowych naczyń włosowatych. Wzrost sieci naczyniowej jest niezbędny dla wielu procesów fizjologicznych, a ponadto występuje w wielu stanach patologicznych zachodzących w organizmie. Jego indukcja wymaga wiązania cząsteczek sygnałowych do receptorów na powierzchni komórek śródbłonka. W przypadku raka lub retinopatii cukrzycowej, jednym z czynników wpływających na progresję choroby jest nadmierna angiogeneza, w przeciwieństwie do upośledzonego gojenia się rany i udaru, które są związane z niewystarczającym tworzeniem naczyń włosowatych. Odpowiednie kompleksy ligand-receptor inicjują szlaki sygnałowe, które promują wzrost i przeżycie nowych naczyń krwionośnych. Nadekspresję NRP-1 wykazano w liniach komórek rakowych, jak również w różnych guzach pierwotnych, np. raka piersi, żołądka i jelita grubego. Korelacja pomiędzy rozwojem nowotworów a zwiększoną gęstością NRP-1 na komórkach sprawia, że receptor ten jest celem terapeutycznym w leczeniu raka. Sugeruje się, że NRP-1 może być głównym receptorem dla VEGF-A165 występującym na błonie komórek guza, podczas gdy interakcja VEGF-A165/NRP-1 może być najistotniejszą przyczyną angiogenezy w chorobach nowotworowych. Kompleks ten zwiększa przeżywalność komórek nowotworowych, ich proliferację i stymuluje złośliwy postęp w przerzutach. Metody modulacji angiogenezy mogą być skuteczniejszym narzędziem przeciw chorobom związanym z tym procesem. Przedstawiona praca doktorska prezentuje optymalizację dwóch testów przesiewowych, które są niezbędne do identyfikacji najlepszych peptydomimetyków wykazujących powinowactwo do NRP-1. Pierwszy z nich pozwolił na określenie aktywności hamującej tworzenie się kompleksu VEGF-A165/NRP-1 zaprojektowanych związków. Badania te przeprowadzono w w Institut Imagine w Paryżu, we współpracy z dr Yves Lepelletier. Przedstawione wyniki pokazały, że test typu ELISA z detekcją chemiluminescencyjną był o wiele czulszym narzędziem, w porównaniu z testem kolorymetrycznym używanym wcześniej do badań powinowactwa NRP-1 w Laboratorium Peptydów. Następny test przesiewowy dotyczył stabilności proteolitycznej. Wykazano istotny wpływ przygotowania próbek krwi do procesu degradacji enzymatycznej, w szczególności przy zastosowaniu antykoagulantów. Drugim celem przedstawionej rozprawy doktorskiej było zaprojektowanie, synteza oraz badania biologiczne peptydomimetyków o wysokim powinowactwie do NRP-1, przy jednoczesnej wysokiej stabilności enzymatycznej. Z przeprowadzonych do tej pory badań dotyczących wymagań strukturalnych ligandów receptora NRP-1 wynika, że aktywny peptyd powinien spełniać tzw. regułę C-końca (ang. C-end rule), czyli posiadać C-terminalny motyw R/KXXR/K. Grupa profesora Perret z Université Paris 13 opracowała i udowodniła antyangiogenną i przeciwnowotworową aktywność heptapeptydu A7R (ATWLPPR). Na podstawie tych badań, w Laboratorium Peptydów Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego opracowano rozgałęzione peptydy o ogólnym wzorze H-Lys-(hArg)-AA2-AA3-Arg-OH, które wykazują lepszą aktywność hamującą kompleks VEGF-A165/NRP-1 niż macierzysty peptyd A7R. Zaprojektowane nowe peptydomimetyki były oparte na tejże ogólnej sekwencji aktywnych inhibitorów. Modyfikacje wprowadzano stopniowo w celu optymalizacji poszczególnych fragmentów cząsteczki. Potwierdzono znaczenie C-końcowej grupy karboksylowej Arg obecnej w każdej sekwencji. Następnie zsyntetyzowano rodzinę peptydomimetyków, w której pozycje AA2 i/lub AA3 zastąpiono monomerami PNA, sarkozyną i mimetykami Pro o różnej sztywności i wielkości pierścienia. Wyniki powinowactwa do NRP-1 i stabilności enzymatycznej otrzymanych związków umożliwiły wybranie najlepszych analogów o 2-4 razy niższej wartości IC50, w porównaniu do wyjściowych sekwencji. Otrzymane wyniki posłużyły dalej jako podstawa do dalszych modyfikacji struktur cząsteczek. Badania stabilności enzymatycznej ujawniły, że wiązanie Lys-ε-hArg stosunkowo szybko ulega hydrolizie enzymatycznej, dlatego wiązanie amidowe w tym fragmencie zostało zastąpione wiązaniem mocznikowym z użyciem pochodnej Arg (Argu). Ta modyfikacja miała korzystny wpływ na stabilność proteolityczną, bez niekorzystnego wpływu na hamującą aktywność większości związków. Inna zaprojektowana rodzina związków zawierała fragment Cys lub Cys-Asp na N-końcu głównego łańcucha peptydomimetyków, lub na grupie α-aminowej hArg. W tej samej kombinacji zastosowano jednostkę mocznikową Cysu. Badania nad powinowactwem związków do NRP-1 wykazały 100-krotny spadek wartości IC50 dla analogów zawierających Cys w porównaniu z macierzystym peptydomimetykiem, niezależnie od miejsca przyłączenia w sekwencji. Jednakże stabilność enzymatyczna tych związków uległa znacznemu obniżeniu. Otrzymane związki poddano następnie dimeryzacji przez mostki dwusiarczkowe tworzące homodimery. Jeden z dimerów wykazał najwyższe powinowactwo do NRP-1 ze wszystkich zaprojektowanych peptydomimetyków. Co więcej, związek ten był również bardzo odporny na degradację enzymatyczną. Badano również wpływ najlepszych związków na żywotność śródbłonkowych i nowotworowych linii komórkowych. Testy żywotności komórek nie wykazały znaczącego wpływu peptydomimetyków na szlak sygnałowy związany z proliferacją komórek. Jednak uzyskane wyniki świadczą o braku cytotoksyczności badanych związków. Wyniki zależności struktura-aktywność przedstawione w ramach zrealizowanej pracy doktorskiej dostarczają nowego wglądu w wymagania strukturalne związków hamujących powstawanie kompleksu VEGF-A165/NRP-1. Opisane peptydomimetyki mogą również przyczynić się do postępu w opracowywaniu nowych leków przeciwko chorobom skorelowanym ze wzrostem naczyń włosowatych. Choroby związane z nadmierną, a także niewystarczającą angiogenezą są jednym z głównych wyzwań we współczesnej medycynie.

Neuropilin-1 (NRP-1) is one of the most important receptors for vascular endothelial growth factor VEGF-A165. This protein participates in enhancing signal transduction in the cell being a co-receptor for vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), but it can also acts independently. NRP-1 plays an important role in angiogenesis, which is the process of new blood capillaries formation. Growth in the vascular network is necessary for a number of physiological processes as well as it is important in pathological conditions taking place in the body. Its induction requires the binding of signal molecules to receptors on the surface of endothelial cells. In the case of cancer or diabetic retinopathy, one of the factors affecting the progression of the disease is excessive angiogenesis, in contrast to impaired wound healing and stroke, that are associated with insufficient capillary vessels formation. Suitable ligand-receptor complexes initiate signalling pathways that promote the growth and survival of new blood vessels. Overexpression of NRP-1 has been demonstrated in cancer cell lines as well as in various primary tumours e.g. breast, gastric and colon cancers. Association with tumour development makes NRP-1 a therapeutic target for treating cancer. It is suggested that NRP-1 may be the main receptor for VEGF-A165 presented on the membrane of tumour cells, while VEGF-A165/NRP-1 interaction could be a major cause of angiogenesis in cancer. This complex increases cancer cells survival, proliferation and stimulates malignant progression in metastatic cell carcinoma. Angiogenesis modulation methods might be a more effective tool against diseases related to this process. Professor Perret's group at Université Paris 13 developed and proved anti-angiogenic and anti-cancer activity of the heptapeptide A7R (ATWLPPR). Based on this research, in the Laboratory of Peptides Faculty of Chemistry, University of Warsaw, we have recently developed branched peptides with the general formula H-Lys-(hArg)-AA2-AA3-Arg-OH, which exhibit better inhibitory activity of the VEGF-A165/NRP-1 complex than the native peptide A7R. The first goal of this Ph.D. dissertation was the optimisation of two screening tests, which were necessary for the best compounds identification. The first of them allowed to determine designed compounds inhibitory activity against VEGF-A165/NRP-1 complex formation. Presented results showed that ELISA-like assay with chemiluminescence detection was a much better tool compared to the colorimetric detection assay, which was previously used for NRP-1 affinity studies in the Laboratory of Peptides. The next screening test concerned proteolytic stability. A significant influence of the blood samples method preparation for enzymatic degradation process was showed, in particular the addition of various anticoagulants. The best matrix for this research was plasma obtained when the sodium citrate as an anticoagulant was used. The second goal of this Ph.D. dissertation was synthesis and biological analysis of peptidomimetics capable of inhibiting the VEGF-A165/NRP-1 complex formation and resistant to enzymatic hydrolysis. Designed compounds were based on the general sequence of active inhibitors shown above. Modifications were introduced gradually to optimise the individual fragments of the molecule (Fig. I). First, the importance of the C-terminal Arg carboxyl group present in each sequence was confirmed. Afterwards, a family of peptidomimetics was synthesised, in which positions AA2 and/or AA3 were substituted with PNA monomers, sarcosine and Pro mimetics with different rigidity and ring size. The results of affinity for NRP-1 and enzymatic stability of obtained compounds enabled to select the best analogues with 2-4 folds lower IC50, compared to the native peptidomimetic HLys( hArg)-Dab-Pro-Arg-OH (2) (IC50 = 9 μM). New active and enzyme-resistant inhibitors, containing Dab-ΔPro (16) (IC50 = 4 μM; t1/2 = 51 h) and Dab-Oic (17) (IC50 = 2 μM, t1/2 = 55h) fragments in the middle part of the general sequence H-Lys(hArg)-AA2-AA3-Arg-OH, served as the basis for further modifications. Fig. I. The general structure of all designed peptidomimetics’ families. Modifications introduced to the molecule have been marked with colours. Enzymatic stability studies revealed that Lys-ε-hArg bond is cleaved, therefore amide bond in this fragment was replaced by urea bond using Arg derivative (Argu). This modification had a beneficial effect on proteolytic stability, without adversely effect on the inhibitory activity of most compounds. Another designed family of compounds contained Cys or Cys-Asp fragment at the N-terminus of the main peptidomimetic chain or on the α-amino group of hArg. In the same combination, Cysu urea unit, was used. Studies on the affinity of compounds for NRP-1 showed a 100 fold drop in IC50 for Cys analogues ( IC50 = 50-70 nM) compared to the native sequence 16 (IC50 = 4 μM), regardless of the site of attachment in the sequence. Unfortunately, the enzymatic stability decreased significantly. Previously obtained compounds were next subjected to dimerization through disulfide bridges forming homodimers. The highest affinity for NRP-1 from all compounds was achieved by peptidomimetic 41 (Fig. II). Moreover, this compound was also very resistant to enzymatic degradation. Fig. II. Structure of the peptidomimetic with the best affinity for NRP-1. Effect of the best compounds on the viability of endothelial and cancer cell lines was also tested. Cell viability assays did not show significant influence of peptidomimetics on the signalling pathway associated with cell proliferation. However, obtained results prove the lack of cytotoxicity of tested compounds. The results of structure-activity relationship presented in this Ph.D. dissertation provide new insight into structural requirements for the inhibition of VEGF-A165/NRP-1 binding by targeting the NRP-1 b1-domain pocket. Described peptidomimetics might also contribute to the progress in the development of new drugs against diseases correlated with the capillary vessels growth. Diseases associated with excessive, as well as insufficient angiogenesis, are a major challenge in modern medicine.