Dynamical properties of the ribosomal decoding site and its complexes with antibiotics

Proces translacji jest jednym z najważniejszych procesów życiowych, zachodzących w każdej żywej komórce. Prowadzi on do syntezy białek na podstawie sekwencji matrycowego kwasu rybonukleinowego (mRNA) i przy udziale transferowego RNA (tRNA). Proces ten jest katalizowany przez rybosomy, kompleksy makromolekularne zbudowane z kwasu rybonukleinowego i z białek. Translacja musi zachodzić z odpowiednią dokładnością, aby syntetyzowane łańcuchy peptydowe miały prawidłową sekwencję. W kontroli dokładności tego procesu jedną z głównych ról odgrywa miejsce odczytu mRNA w rybosomie (tzw. miejsce A). W miejscu A znajdują się dwie ruchliwe konserwatywne adeniny, które pośredniczą w tworzeniu kompleksu między mRNA i tRNA, pośrednio zapewniając przyłączenie odpowiedniego aminokwasu do łańcucha peptydowego. Ten proces może być zaburzony przez wiązanie w miejscu A antybiotyków aminoglikozydowych. Są one stosowane w szpitalach w przypadku ciężkich infekcji, ale mogą niestety powodować poważne skutki uboczne, takie jak uszkodzenie słuchu. Jedną z przyczyn jest niska selektywność aminoglikozydów, które wiążą się też z miejscem A w ludzkim rybosomie. Ponadto aminoglikozydy, podobnie jak inne antybiotyki, stosunkowo szybko wywołują oporność bakterii. Te problemy stały się motywacją do moich badań. Wykorzystując symulacje komputerowe, badałam własności fizyko-chemiczne miejsca A w kontekście dokładności procesu odczytu mRNA oraz czynników wpływających na tę dokładność, takich jak antybiotyki. Jako że w badanym procesie niezwykle istotny jest aspekt dynamiczny, podstawową zastosowaną metodą obliczeniową była dynamika molekularna, która pozwala na śledzenie dostępnych konformacji układu w czasie. Najpierw zajęłam się zmodyfikowanymi chemicznie analogami kwasów nukleinowych, które mogą być kowalencyjnie dołączone do aminoglikozydu, zwiększając selektywność wiązania antybiotyku i przeciwdziałając niektórym mechanizmom oporności bakterii. Wskazałam własności dynamiczne wybranych oligonukleotydów tłumaczące ich względnie silne wiązanie do RNA, co może ułatwić projektowanie związków bazujących na oligonukleotydach. Drugim nurtem badań było dokładniejsze poznanie własności fizyko-chemicznych i strukturalnych miejsca A. W szczególności porównywałam dynamikę jego bakteryjnego i ludzkiego wariantu, różniących się sekwencją RNA. To pozwoliło na identyfikację czynników konformacyjnych mogących wpłynąć na dokładność procesu odczytu mRNA oraz na różnice w powinowactwie wiązania antybiotyków aminoglikozydowych. Następnie badałam też mechanizmy bakteryjnej oporności na aminoglikozydy, spowodowanej mutacjami w rybosomowym białku S12, które sąsiaduje z miejscem A. Badania te pozwoliły zaproponować strukturalno-dynamiczne mechanizmy dezaktywacji aminoglikozydów w wyniku mutacji. Wyniki moich badań poszerzyły wiedzę na temat mechanizmu odczytu mRNA w rybosomie u bakterii i u człowieka, oraz czynników które mogą wpływać na jego dokładność. Moje badania również wskazują na przyczyny różnic w wiązaniu aminoglikozydów do ludzkich i bakteryjnych wariantów miejsca A. W dalszej perspektywie wiedza ta może się przyczynić do projektowania skuteczniejszych antybiotyków. Ponadto w niniejszej pracy szczegółowo przedyskutowałam wybór metod, co może wspomóc przyszłe badania nad dynamiką układów złożonych z RNA, podobnych do miejsca A.

Translation process is one of the key processes of life and it occurs in every living cell. In this process amino acid chains of proteins are synthesized based on the matrix of messenger ribonucleic acid (mRNA) sequence with the participation of transfer RNA (tRNA). Translation is performed by ribosomes, which are large macromolecular assemblies of RNA and proteins. Importantly, this process must proceed with sufficient accuracy, which is ensured by the mRNA decoding site (A-site) on the ribosome. During elongation of peptide chain, the two flexible adenines in the A-site mediate interactions between mRNA and tRNA that carries the proper amino acid. A-site is also a target for aminoglycoside antibiotics, which perturb the mRNA decoding process in bacteria. This class of compounds is used in hospitals for severe infections. Unfortunately, aminoglycoside therapy may cause serious adverse effects. One of the reasons is insufficient specificity of aminoglycosides to their main target; they also bind to the A-site on the human ribosome. Another problem is that bacteria relatively quickly develop resistance to any antibacterials, including aminoglycosides. Thus, there is a need for research aimed at improving the properties of these antibiotics. In this thesis we applied computational methods to study the A-site physico-chemical properties in the context of the mRNA decoding accuracy and aminoglycoside binding. Since the dynamical aspect is critically important for the mRNA decoding process, we used molecular dynamics simulation techniques as a main research method. First, we investigated the physico-chemical properties of the modified oligonucleotides (like peptide nucleic acid) that can be covalently attached to aminoglycoside. Such chemical compounds can increase selectivity of aminoglycosides by complementary binding to ribosomal RNA in the proximity of the A-site. We found different conformational preferences of the studied oligonucleotides, which could be useful for the oligonucleotide-based antibiotic design. Further, we compared physico-chemical properties of the aminoglycoside targets: the bacterial and human A-site variants, which differ in RNA sequences. We identified conformational factors explaining the differences in aminoglycoside binding affinities towards the A-site variants and the known different translation accuracies in different life domains (e.g., human and bacteria). Finally, we investigated resistance mutations in the ribosomal protein S12, which is located proximal to the A-site. The mutations are known to counteract the bactericidal mechanism of action of aminoglycosides. Based on our data we suggested the structural mechanisms of the antibiotic deactivation in the mutants. In conclusion, this work extends the knowledge on the mRNA decoding in bacteria and human, and on the factors that may affect accuracy of this process. Results of this work also explain the differences in affinities and activities of aminoglycosides towards the human and bacterial A-site. In the future this knowledge may help in the design of more effective antibiotics. Finally, in this thesis we thoroughly discussed the choice of the applied simulation methods, which may serve as a guide in choosing the proper computational protocols for the studies of the RNA systems similar to the A-site.