Modyfikacja akumulacji i tolerancji tytoniu i pomidora na cynk, żelazo i kadm w wyniku ekspresji genu AhNAS2

Nikotianamina (NA) to niebiałkowy aminokwas powszechnie występujący u roślin syntetyzowany enzymatycznie przy udziale syntazy nikotianaminy (NAS). Związek ten jest chelatorem Fe2+ i Fe3+, a także innych jonów, m. in. Zn2+, Cu2+ i Ni2+. Uważa się, że NA odgrywa ważną rolę w regulacji utrzymywania homeostazy komórkowej metali, a w konsekwencji poziomu tolerancji rośliny w odpowiedzi na deficyt lub nadmiar określonych metali. W oparciu o tę wiedzę, celem pracy było określenie przydatności ekspresji AhNAS2p::AhNAS2 z Arabidopsis halleri (hiperakumulatora Zn i Cd) dla modyfikacji poziomu tolerancji tytoniu i pomidora na niedobór i/lub nadmiar żelaza i cynku, a także akumulacji i dystrybucji tych metali pomiędzy organami. Ważnym elementem badań było także określenie czy ekspresja AhNAS2 wpłynie na odpowiedź roślin na kadm. Praktyczny aspekt badań stanowiła ocena możliwości wykorzystania transformacji genem AhNAS2 dla celów biofortyfikacji żywności (Fe, Zn) i/lub fitoremediacji gleb zanieczyszczonych Zn i Cd. W pracy weryfikowano założenie, że zwiększenie w wyniku ekspresji AhNAS2p::AhNAS2 poziomu NA (odgrywającej kluczową rolę w transporcie krótko- i długodystansowym metali) w roślinie przyczyni się do zwiększenia poziomu tolerancji na niedobór a także nadmiar Zn i Fe. W przypadku roślin pomidora transformacja genem AhNAS2 w uprawach hydroponicznych prowadziła do wzrostu tolerancji na deficyt Fe i obecność Cd, co obserwowano jako stopniowe zazielenianie się blaszek liściowych, na których wcześniej widoczne były chlorozy. Jednocześnie stwierdzono wzrost pobierania i translokacji Fe oraz zahamowanie pobierania i translokacji Cd. Ważnym z punktu widzenia roli NA w roślinach okazało się jej uczestnictwo w tworzeniu kompleksów z Cd. Istotnym wynikiem było także stwierdzenie u roślin pomidora z ekspresją AhNAS2p::AhNAS2 wzrostu poziomu tolerancji na nadmiar Fe. Badania pełnego przebiegu cyklu życiowego roślin pomidora z ekspresją genu AhNAS2 podczas uprawy glebowej wykazały, iż u transformantów występuje tendencja do obniżania stężenia Cd w liściach oraz wzrostu stężenia Fe w nasionach. Ponadto, ekspresja genu AhNAS2 nie wpłynęła w istotny sposób na modyfikację kwitnienia i owocowania roślin. Z kolei w badaniach przeprowadzonych na roślinach tytoniu z ekspresją AhNAS2p::AhNAS2 wykazano brak znaczących modyfikacji w odpowiedzi na zastosowane stężenia Fe, Zn i Cd. Podsumowując, wyniki pracy doktorskiej pokazały, iż zastosowanie natywnego promotora AhNAS2p do ekspresji heterologicznej genów NAS jest obarczone dużym ryzykiem niepowodzenia zamierzonej transformacji. Transformacja genem AhNAS2 prowadzi do znacznych, ale niespecyficznych modyfikacji procesów regulujących homeostazę metali. Zmiany poziomu akumulacji Fe, Zn i Cd oraz tolerancji roślin tytoniu i pomidora w porównaniu z typem dzikim były niewielkie i odmienne od tych, które zostały już opisane w literaturze. Nie jest wykluczone, iż promotor AhNAS2p nie odpowiada na sygnały generowane w badanych gatunkach przy zastosowanych kombinacjach stężeń metali Fe, Zn i Cd.

Nicotianamine (NA) is nonprotein amino acid ubiquitous in plants, which is enzymatically synthesized by nicotianamine synthase (NAS). This compound chelates Fe2+ and Fe3+, as well as other metal ions, such as Zn2+, Cu2+ and Ni2+. It is believed that NA plays a major role in maintaining cellular homeostasis of metal ions, and, as a result, in regulating plants response to deficiency and excess of metals. Based on this knowledge, goal of this thesis was to assess if expression of AhNAS2p::AhNAS2 from Arabidopsis halleri (hyperaccumulator of Zn and Cd) can be useful for modification of tobacco and tomato tolerance to iron and zinc deficiency or excess, as well as for modification of accumulation and distribution of those metals between plant organs. Other major point of research was to determine whether AhNAS2 expression will influence plant response to cadmium. Practical aspect of this thesis was to evaluate viability of transformation AhNAS2 gene for purpose of food biofortification (Fe, Zn) or phytoremediation of soil contaminated with Zn and Cd. This thesis has been verifying an assumption that by using AhNAS2p::AhNAS2 expression to increase levels of NA (which plays major role in short- and long-distance metal transport) in plant will contribute to increase tolerance to insufficient and excess concentrations of Zn and Fe. In case of tomato plants, transformation with AhNAS2 gene in hydroponic crops has led to an increase of tolerance to Fe deficiency with presence of Cd, which manifested as a gradual greening of leaves that had visible chlorosis. At the same time an increase in Fe uptake and translocation, as well as decrease in Cd uptake and translocation, have been observed. NAs participation in creation of NA-Cd complexes proved important in regard to its role in plants. Another relevant result was an increased tolerance to excess amount of Fe observed in tomato plants expressing AhNAS2p::AhNAS2. Study of full lifetime of tomato plants expressing AhNAS2 gene during their cultivation in soil have shown that transformants have tendency to lower Cd concentration in leaves and higher Fe concentration in seeds. Apart from that, AhNAS2 gene expression has not influenced plant growth and creation of fruits in a meaningful way. On the other hand, studies conducted on tobacco plants expressing AhNAS2p::AhNAS2 have not shown any major modification in plants response to used combinations of Fe, Zn and Cd concentrations. Results of this thesis show, that using AhNAS2p native promoter for heterologous NAS gene expression has a high risk of failure to achieve intended transformation. AhNAS2 gene transformation leads to major, yet not specific modifications of processes regulating metal homeostasis. Changes in Fe, Zn and Cd accumulation and tobacco and tomato tolerance were minor in comparison with wild type and different than those already described in literature. It is likely that AhNAS2p promoter does not respond to signals generated by studied species when grown on used combinations of Fe, Zn and Cd concentrations.