Rola miR-99b-5p w odpowiedzi komórek zrębowych szpiku kostnego na hipoksję i normoksję podczas osteogenezy in vitro

Komórki zrębowe szpiku kostnego należą do mezenchymalnych komórek macierzystych i mogą różnicować się m.in. w komórki linii kostnej. Zaburzenia osteogenezy mogą prowadzić do powstawania skostnień heterotopowych, czyli tkanki kostnej w miejscach, w których fizjologicznie nie powinna ona występować. W regulacji różnicowania osteogennego mogą uczestniczyć mikroRNA, w tym potencjalnie miR-99b-5p (miR-99b). Celem pracy było zbadanie wpływu zwiększonego poziomu miR-99b, uzyskanego poprzez transfekcję komórek hMSC miR-99b mimic, na różnicowanie osteogenne oraz chondrogenne w warunkach normoksji i hipoksji. W badaniu oceniono poziom miR-99b oraz ekspresję genów RUNX2 i BMP4 metodą qPCR. Następnie wykonano barwienia histochemiczne błękitem Alcjańskim oraz czerwienią alizarynową S, pozwalające ocenić odpowiednio obecność składników macierzy zewnątrzkomórkowej charakterystycznych dla różnicowania chondrogennego oraz mineralizację macierzy zewnątrzkomórkowej. Uzyskane wyniki wykazały, że transfekcja miR-99b mimic zwiększała poziom miR-99b w komórkach hMSC, a wyższy poziom tej cząsteczki odnotowano w warunkach hipoksji. Ekspresja BMP4 była wyższa w komórkach hodowanych w pożywkach indukujących różnicowanie, natomiast ekspresja RUNX2 wykazywała większe zróżnicowanie w zależności od warunków hodowli. Barwienie błękitem Alcjańskim wskazywało, że hipoksja, szczególnie w połączeniu z transfekcją miR-99b mimic, mogła sprzyjać wytwarzaniu składników macierzy zewnątrzkomórkowej związanych z różnicowaniem chondrogennym. Mineralizacja macierzy zewnątrzkomórkowej, oceniana czerwienią alizarynową S, była najintensywniejsza w komórkach hodowanych w pożywce osteogennej w warunkach normoksji. Wyniki sugerują, że miR-99b może potencjalnie uczestniczyć w regulacji różnicowania komórek hMSC, szczególnie w hipoksji i środowisku sprzyjającym różnicowaniu chondrogennemu. Jednoznaczna ocena udziału miR-99b w regulacji osteogenezy oraz powstawania skostnień heterotopowych wymaga dalszych badań.

Bone marrow stromal cells are a type of mesenchymal stem cell and are able to differentiate into several cell types, including cells of the osteogenic lineage. Disturbances in osteogenesis may lead to heterotopic ossification, defined as the formation of bone tissue in sites where it does not normally occur. MicroRNAs, including potentially miR-99b-5p (miR-99b), may participate in the regulation of osteogenic differentiation. The aim of this study was to investigate the effect of an increased miR-99b level, obtained by transfection of hMSC cells with miR-99b mimic, on osteogenic and chondrogenic differentiation under normoxic and hypoxic conditions. In this study, the level of miR-99b and the expression of RUNX2 and BMP4 genes were assessed using qPCR. Then, histochemical staining with Alcian Blue and Alizarin Red S was performed, allowing the evaluation of extracellular matrix components characteristic of chondrogenic differentiation and extracellular matrix mineralization. The obtained results showed that transfection with miR-99b mimic increased the level of miR-99b in hMSC cells, and a higher level of this molecule was observed under hypoxic conditions. BMP4 expression was higher in cells cultured in differentiation-inducing media, whereas RUNX2 expression showed greater variability depending on the culture conditions. Alcian Blue staining indicated that hypoxia, especially in combination with miR-99b mimic transfection, could promote the production of extracellular matrix components associated with chondrogenic differentiation. Extracellular matrix mineralization, assessed using Alizarin Red S staining, was most intense in cells cultured in osteogenic medium under normoxic conditions. The results suggest that miR-99b may potentially participate in the regulation of hMSC differentiation, particularly under hypoxic conditions and in an environment promoting chondrogenic differentiation. However, further studies are required to clearly determine the role of miR-99b in the regulation of osteogenesis and the formation of heterotopic ossification.