Mechanizm działania jonów ołowiu na reakcje świetlne fotosyntezy u roślin C3 i C4

Metale ciężkie są obecnie jednym z najpowszechniejszych zanieczyszczeń środowiska. Obieg metali ciężkich w naturalnym środowisku związany jest z wietrzeniem skał, erupcją wulkanów, procesami glebotwórczymi. Metale ciężkie dostają się do środowiska również za sprawą człowieka. Rośliny wykształciły dwa podstawowe mechanizmy odporności na metale ciężkie: unikanie oraz tolerancję. Po przedostaniu się do chloroplastów metale ciężkie mogą uszkadzać aparat fotosyntetyczny. W przeważającej większości prace dotyczące wpływu metali ciężkich na fotosyntezę skupiają się na ich oddziaływaniu na wiązanie dwutlenku węgla w cyklu Calvina- Bensona. Wiadomo bowiem, że metale, w tym jony Pb obniżają aktywność Rubisco oraz PEPC przez oddziaływanie z grupami –SH znajdującymi się w centrum aktywnym enzymów. Badania mające na celu określenie wpływu ołowiu na fazę jasną fotosyntezy prowadzono głównie w układach in vitro, w których ołów podawano bezpośrednio do chloroplastów. Stwierdzano wówczas zmiany w obrębie kompleksu utleniającego wodę (OEC), co przekładało się na ograniczenie transportu elektronów i generowanie stresu oksydacyjnego, prowadzącego do uszkadzania kompleksów błonowych. Badania prowadzono na liściach kukurydzy i grochu, reprezentujących dwa różne typy fotosyntezy, C4 i C3. Ołów w postaci rozpuszczalnej soli azotanowej podawano przez dobę wraz z prądem transpiracyjnym do odciętych liści kukurydzy bądź pozbawionych systemu korzeniowego pędów grochu. Rośliny będące obiektem badań rosły przy dwóch natężeniach światła: niskim (LL, 80 μmol m-2 s-1) oraz wysokim (HL, 600 μmol m-2 s-1). Obecność metalu ciężkiego w badanym materiale roślinnym potwierdzono przy zastosowaniu absorpcyjnej spektrometrii atomowej oraz mikroskopii elektronowej. W przedstawionej pracy po raz pierwszy pokazano, że wzmożona fosforylacja białek PSII w warunkach działania metalu ciężkiego może pełnić funkcję ochronną. Jony ołowiu stymulowały fosforylację białka D1 rdzenia PSII oraz niskocząsteczkowego białka PsbH, stabilizującego strukturę dimeryczną aktywnej postaci fotoukładu II. Fosforylację badano metodą immunodetekcji oraz spektrometrii masowej. Zarówno daleka czerwień, jak i ciemność, nie miały wpływu na defosforylację białka D1. Podawanie ołowiu w postaci 5 mM Pb(NO3)2 nie powodowało zmian w organizacji kompleksów białkowo- barwnikowych błon tylakoidowych w chloroplastach grochu oraz w chloroplastach komórek mezofilowych kukurydzy. Koreluje to z niezmienioną aktywnością fotoukładów w wymienionych typach chloroplastów, jak również z pomiarami fluorescencji chlorofilu a in vivo. Traktowanie roślin solą ołowiu, a następnie działanie wysokim natężeniem światła, powodującym fotoinhibicję nie wpływało na zawartość białka D1. Prawdopodobnie fosforylacja białka D1 w obecności metali ciężkich stanowi jeden z mechanizmów ochrony przed proteazami, gdyż białka ufosforylowane nie są degradowane, co warunkuje zachowanie aktywności fotosyntetycznej roślin. W przedstawionej rozprawie wykazano, że w liściach kukurydzy pierwszym miejscem działania dla docierającego wraz z prądem transpiracyjnym metalu są chloroplasty komórek pochew wokółwiązkowych. Obniżeniu ulegała w nich aktywność PSI i PSII, rozpadały się superkompleksy obydwu fotoukładów oraz miała miejsce monomeryzacja systemów antenowych LHCII. Ponadto przeprowadzone doświadczenia potwierdziły, że bardziej wrażliwa na działanie metali ciężkich jest faza ciemna fotosyntezy, a wpływ na fazę jasną ma głównie charakter zmian funkcjonalnych, nie strukturalnych. Wykazano, że budowa oraz różny metabolizm chloroplastów wpływają na ich odpowiedź na stres środowiskowy, jakim jest metal ciężki. Jednak istnieją wspólne mechanizmy, które pozostają uniwersalne, niezależnie od gatunku rośliny.

Heavy metals (HM) are widespread phytotoxic pollutants. Most of them are absorbed by the root of plants, where they can be accumulated. When the roots tolerance threshold is bridged, metals are translocated toward the leaves and affect the photosynthetic apparatus, but the mechanisms of HM toxicity to photosynthesis is still a matter of speculations. One of the heavy metals, that is not essential for plants growth is lead. The primary inhibitory site is supposed to be at the level of the Calvin cycle enzymes. Lead was also reported to disturb the granal structure of chloroplasts, reduce photosynthetic electron transport and affect the oxygen evolving complex. The aim of my studies was to compare the ways, the lead ions affect light reactions of photosyntesis in three types of chloroplasts: pea chloroplasts, maize mesophyll chloroplasts and maize bundle sheaths chloroplasts, differing structurally and functionally. Lead solution was introduced into the leaves (maize) or steams (pea) with transpiration stream (Pb ions would be introduced rapidly into the photosynthetic tissues). Plants were grown under two light conditions: low and high light. After 24 h of continuous exposure to relevant solutions, leaves were harvested for the experiments. Accumulation of Pb ions was higher in leaves of plants grown under both: LL than HL when compared with control, but effects of Pb ions were independent on light intensity during the growth. In the first step of my experiments, I measured intensity of photosynthesis and respiration. A decrease of CO2 fixation in metal- stressed plants was observed and at the same time respiration rate increased. Higher rate of respiration correlated with higher ATP/ADP ratio in the leaves. It was shown in our lab that stimulation of respiration in the leaves treated with lead remains in a close relationship with activation of malate dehydrogenase and stimulation of the mitochondrial ATP production. In the next step of my experimental work I analyzed the chlorophyll a by in vivo fluorescence. The presence of Pb ions did not affect photochemical efficiency of PSII and only a small reduction (about 10%) was observed in the measured Fv/Fm ratio (maximal efficiency of PSII). These results are in agreement with the observation that PSII activity was not affected by lead in thylakoids isolated from pea, and maize mesophyll chloroplasts, confirmed by similar results in the DCPIP photoreduction experiment. This activity results were measured spectrophotometrically. Contrary to PSII activity, presence of Pb ions had inhibitory effect on electron transport through PSII in bundle sheath thylakoids. In this case, when an extrinsic electron donor DPC was added the oxygen evolving complex reaction is omitted and the activity of PSII increases, thus the damaged caused by presence of Pb ions appeared to begin on the donor side of PSII. To investigate the possible effects of Pb ions on the organization of the major protein complexes in the thylakoid membrane from all the three types of chloroplasts, I employed blue-native (BN) electrophoresis. In this assay protein profiles obtained for control and Pb-treated leaves were similar, which demonstrated that lead does not disturb organization of thylakoid complexes. This stands in agreement with the fluorescence measurements and PSII activities. The reversible protein phosphorylation is a crucial mechanism, which is involved in metabolism as well as the regulation and stabilization of protein structure in stress conditions became my next focus. Therefore the next step of my investigation was phosphorylation. In my studies Pb ions significantly enhanced phosphorylation of the D1 protein in thylakoid membranes, as it was shown in the immunodetection analysis with antibodies. To make the quantification of the phosphorylation changes in the PSII core proteins upon lead treatment the nano- liquid chromatography mass spectrometry was used. This experiment was performed in collaboration with professor Vener team from Linköping University, Sweden. The quantitative results on the level of the phosphorylation for the PSII proteins were in agreement with the data obtained from western blotting. I detected a very strong phosphorylation of D1 and PsbH proteins after Pb treatment in both chloroplast types. It was found, that the phosphorylated form of D1 was resistant to degradation, while PsbH was essential for stabilization of the dimeric active form of photosystem II. The phosphorylation of the D1 protein after 24 hours of Pb treatment was maximal and did not change in dephosphorylation conditions, such as far red light and darkness. Moreover, the high light, which induces photoinhibitory effects did not caused changes in total amount of D1 protein. As it is known, phosphorylation protects D1 protein from oxidative damage by down-regulation of the production of superoxide anion in photosynthetic membranes under high light conditions. Therefore changes in phosphorylation of PSII core proteins induced by Pb ions may be a crucial regulation step in protection mechanism important for stabilization of the dimeric PSII complex in metal-stress conditions. My results show that acclimation to Pb ions was achieved in all types of investigated chloroplasts in the same way. However, these processes are obviously more complex because of their different metabolic status.