Rola kompleksu egzocysty i pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w transporcie rozpuszczalnych białek do rzęski pierwotnej

Rzęska pierwotna jest organellą komórkową opartą na cytoszkielecie mikrotubularnym, która jako swoisty węzeł komunikacyjny koordynuje sygnały zewnątrzkomórkowe i przekształca je na odpowiedzi wewnątrzkomórkowe. Odgrywa kluczową rolę w rozwoju embrionalnym, a także w wielu procesach sygnałowych integrując wiele szlaków sygnalizacyjnych m.in. Wnt, PDGFR, Notch, TGF-β, mTOR oraz Hedgehog (Hh), dla którego jest kluczowym elementem dla jego prawidłowego funkcjonowania. Ścieżka Hh jest jednym z najważniejszych szlaków sygnalizacyjnych w rozwoju embrionalnym jak i u organizmów dorosłych, a jej dysfunkcje prowadzą do zaburzeń rozwojowych oraz nowotworów m.in. rdzeniaka zarodkowego u dzieci. Zależna od rzęski sygnalizacja Hh przekazuje sygnał do jądra komórkowego za pośrednictwem czynników transkrypcyjnych Gli. Co ciekawe, pod wpływem aktywacji ścieżki, białka Gli gromadzą się na wierzchołku rzęski, gdzie nabywają zdolność do roli aktywatorów transkrypcji. Jednakże, mechanizm transportu Gli do rzęski pozostawał do tej pory nieznany. Dotychczas, badacze skupiali się przede wszystkim na rzęskowym transporcie receptorów błonowych, nie wiadomo natomiast jaki mechanizm transportu wykorzystują białka rozpuszczalne w cytoplazmie, takie jak Gli. Badania wstępne wykazały wiązanie białek Gli z podjednostkami kompleksu egzocysty, znanego ze swojej roli w transporcie pęcherzyków wewnątrzkomórkowych. Na podstawie tych doświadczeń oraz przeglądu literatury postawiono hipotezę, że kompleks egzocysty bierze udział w ukierunkowanym transporcie białek rozpuszczalnych do rzęski pierwotnej. Do realizacji niniejszej pracy doktorskiej wykorzystano szereg nowoczesnych technik inżynierii genetycznej m.in. techniki utraty funkcji, w tym mutagenezę z użyciem CRISPR-Cas9, system indukcji ekspresji Tet-ON, jak również transdukcję wirusową. Wykorzystywano dwie modelowe mysie linie komórkowe NIH3T3 i IMCD3 z systemem wprowadzania zmodyfikowanej uprzednio sekwencji DNA oraz ludzkie komórki HEK293T. Do badania natury oddziaływań stworzono unikalny system pułapki mitochondrialnej oraz zastosowano test ligacji zbliżeniowej. Analizy i badania proteomiczne przeprowadzano wykorzystując spektrometrię mas oraz techniki koimmunoprecypitacji. Wśród metod obrazowania należy wymienić mikroskopię fluorescencyjną, konfokalną, w tym wysokorozdzielczą AiryScan oraz elektronową. W wyniku realizacji projektu doktorskiego potwierdzono, że kompleks egzocysty oddziałuje z białkami Gli zarówno na poziomie biochemicznym, jak i funkcjonalnym. Zaburzenie funkcji egzocysty upośledzało transport białek Gli do rzęski pierwotnej. Następnie, z wykorzystaniem wysokorozdzielczych technik mikroskopowych pokazano, iż białka Gli wraz z kompleksem egzocysty lokalizują się wokół pęcherzyków wewnątrzkomórkowych. By poznać bliżej mechanizm transportu do rzęski, komórki traktowano inhibitorami endocytozy, jak również inhibitorami aktyny wykazując, że obserwowane pęcherzyki to endosomy, które mogą przemieszczać się do podstawy rzęski z udziałem cytoszkieletu aktynowego. W tym samym celu badano znane ze swego zaangażowania w transport pęcherzyków białka pomocnicze z rodziny GTPaz. Na podstawie dostępnych w literaturze analiz wielkoskalowych oraz przeprowadzonej spektrometrii mas, wytypowano, a następnie potwierdzono, iż białka Rab14, Rab 18, Rab23 oraz Arf4 uczestniczą w transporcie białek Gli do rzęski. Na koniec postawiono pytanie czy odkryty proces jest wykorzystywany również przez inne białka rzęskowe rozpuszczone w cytoplazmie. Wśród kilku kandydatów, pokazano, że białko Lkb1 wykorzystuje ten sam mechanizm. Niniejsza praca doktorska ukazuje nowy, zależny od pęcherzyków szlak transportowy dla rozpuszczalnych białek rzęskowych, jak również zwiększa naszą wiedzę na temat kluczowych etapów sygnalizacji Hh. Uzyskane wyniki mogą przyczynić się do lepszego rozumienia charakteru ciliopatii oraz zaburzeń związanych ze szlakami sygnalizacyjnymi.

The primary cilium is a cellular microtubule-based organelle that acts as a specific communication hub and coordinates extracellular signals converting them into intracellular responses. It plays a key role in embryonic development and many signaling processes by integrating multiple signaling pathways including Wnt, PDGFR, Notch, TGF-β, mTOR, and Hedgehog (Hh), for which it is a crucial element for its proper functioning. The Hh pathway is one of the most important signaling pathways in embryonic development as well as in adult organisms, and its dysfunctions lead to developmental disorders and cancers such as children’s medulloblastoma. Cilia-dependent Hh signaling transmits a signal to the cell nucleus via Gli transcription factors. Interestingly, under activation of the pathway, Gli proteins accumulate at the tip of the cilium where they acquire the capacity to act as activators of transcription. However, the mechanism of Gli transport to the cilium remained unknown. To date, researchers have been primarily focused on the ciliary transport of membrane receptors, while it is not known what mechanism is used by cytoplasm-soluble proteins, such as Gli. Preliminary studies have shown the interaction of Gli proteins with subunits of the exocyst complex, known for its role in intracellular vesicle transport. Based on these experiments and a literature review, a hypothesis was raised that the exocyst complex is involved in the targeted transport of soluble proteins into the primary cilium. Several state-of-the-art genetic engineering techniques including CRISPR-Cas9 mutagenesis for loss-of-function approach, the Tet-ON expression induction system, as well as viral transduction, were used to carry out this thesis. Two mouse model cell lines NIH3T3 and IMCD3 with a pre-modified DNA sequence insertion system and human HEK293T cells were used. A unique mitochondrial trapping system was created, and a proximity ligation assay was used to study the nature of the interactions. Proteomic studies were carried out using mass spectrometry and coimmunoprecipitation techniques. Among imaging methods, fluorescence microscopy, confocal microscopy, including high-resolution AiryScan, and electron microscopy are worth mentioning. As a result of the PhD project, it was confirmed that the exocyst complex interacts with Gli proteins at both biochemical and functional levels. Disruption of exocyst function impaired the transport of Gli proteins into the primary cilium. Subsequently, using high-resolution microscopic techniques, it was shown that Gli proteins together with the exocyst complex, localize around intracellular vesicles. To gain further insight into the mechanism of Gli transport to the cilium, cells were treated with endocytosis inhibitors as well as actin inhibitors, demonstrating that the observed vesicles are indeed endosomes that can move to the base of cilia using the actin cytoskeleton. To the same end, proteins of the GTPase family, known for their involvement in vesicle transport, were studied. Based on the large-scale analyses available in the literature and the mass spectrometry performed, Rab14, Rab18, Rab23, and Arf4 proteins were selected and subsequently confirmed to be involved in the transport of Gli proteins into the primary cilium. Finally, the question was raised whether the discovered process is used by other ciliary soluble proteins as well. Among several candidates, the Lkb1 protein was shown to use the same mechanism. This PhD thesis reveals a new vesicle-dependent transport mechanism for soluble ciliary proteins, as well as increases our knowledge of key steps in Hh signaling. The results obtained may contribute to a better understanding of the nature of ciliopathies and signaling pathways-associated disorders.