Wykorzystanie niekanonicznych kodonów startu translacji do syntezy alternatywnych form białek kierowanych do mitochondriów

Translacja jest jednym z najważniejszych procesów w każdej żywej komórce. U organizmów eukariotycznych zdecydowana większość transkryptów podlega kanonicznej translacji, która zachodzi według modelu skanującego. Po rozpoznaniu kodonu startu translacji przez małą podjednostkę rybosomu i przyłączeniu dużej podjednostki następuje synteza białka na matrycy mRNA, która ulega terminacji gdy rybosom dociera do kodonu STOP. Następuje wówczas dysocjacja rybosomu oraz odłączenie mRNA i nowopowstałego peptydu. Inicjacja translacji nie zawsze jednak zachodzi z kodonu AUG. W niektórych przypadkach miejsce startu translacji stanowią również kodony inne niż AUG (non-AUG). Możliwe jest również wykorzystanie do translacji jednego transkryptu dwóch miejsc: kanonicznego kodonu AUG i alternatywnego non-AUG położonego poniżej lub powyżej. W wyniku takiego procesu syntetyzowanych jest kilka izoform białek, podstawowa powstała z kanonicznego miejsca inicjacji translacji i dodatkowe syntetyzowane z kodonu non-AUG. Wykorzystanie alternatywnego miejsca inicjacji translacji (aTIS) wydaje się bardziej powszechne u wirusów i w komórkach ssaczych, natomiast u drożdży Saccharomyces cerevisiae opisano do tej pory tylko pięć takich przypadków, dla których kanoniczny wariant białka jest obecny w cytozolu, a wydłużona izoforma lokalizuje się w mitochondrium. W pracy wykazano, że u drożdży zjawisko syntezy dwóch form białkowych dzięki wykorzystaniu aTIS jest zdecydowanie bardziej powszechne niż sądzono i w wielu przypadkach prowadzi do podwójnej lokalizacji białek. Wykonane analizy bioinformatyczne wskazują, że około 2/3 białek w genomie drożdżowym może posiadać non-AUG aTIS, z czego ponad 500 zyskuje lokalizację mitochondrialną w formie wydłużonej. Eksperymentalnie potwierdzono lokalizację mitochondrialną 23 różnych białek, z których 19 nie było wcześniej obserwowane w mitochondriach. Ponadto, przeprowadzono systematyczne badania dotyczące podwójnej lokalizacji białka Trz1, które wykazały, że to właśnie wydłużona izoforma odpowiada za jego funkcje mitochondrialne. Dane przedstawione w pracy pozwalają na wyjaśnienie złożoności i różnorodności proteomu mitochondrialnego oraz wskazują na znaczący wpływ inicjacji translacji z kodonów non-AUG w tworzeniu alternatywnych form białek, które mogą pełnić różnorakie funkcje.

Translation is one of the most important processes in every living cell. In eukaryotes the majority of transcripts are translated in a canonical manner usingthe scanning model of translation. After joining of the large ribosome subunit, the mature ribosome starts translation and synthesizes protein until the STOP codon is reached. The ribosome then splits into two subunits and the mRNA which encoded the nascent protein is released. However, translation initiation does not always occur at an AUG start codon. In some cases, non-AUG codons serve as translation initiation start sites. It is possible to utilise two different codons as start sites in one transcript: a canonical AUG and an alternative upstream or downstream non-AUG. Utilization of non-AUG alternative translation initiation sites (aTIS) is most common in viruses and mammalian cells. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, five described cases concern proteins that are translated from upstream near-cognate start codons as N-terminally extended variants that localize to mitochondria. In this work I show that in yeast the potential for producing alternative protein isoforms by non-AUG translation initiation is much more prevalent than previously anticipated and may generate an unidentified pool of mitochondrial proteins. A bioinformatics analysis performed in my research group shows that about 2/3 of proteins in the yeast genome have predicted one or more upstream aTIS, with more than 500 gains in mitochondrial localisation as the extended isoforms. I confirmed mitochondrial localisation of 23 different proteins previously not recognized as mitochondrial whose standard forms do not carry an MTS. I also analysed the dual localisation of the Trz1 protein, which has been shown to localise and function in both the nucleus and mitochondria. I verified that the extended non-AUG isoform is responsible for mitochondrial localisation and functions of Trz1. My data highlight the potential of non-canonical translation initiation in expanding the capacity of the mitochondrial proteome and possibly also other cellular features.