Funkcja dwuskładnikowego systemu transdukcji sygnału EnvZ/OmpR w kontroli ruchliwości oraz modulowaniu wirulencji Yersinia enterocolitica

Y. enterocolitica jest ludzkim enteropatogenem, czynnikiem etiologicznymi jersiniozy – odzwierzęcej choroby zakaźnej, która może przybierać różne postaci kliniczne: jelitowe, pseudowyrostkowe, posocznicowe, rumieniowe i stawowe. Jersinioza jest trzecią, po kampylobakteriozie i salmonellozie, zoonozą pod względem częstości występowania w Europie. Y. enterocolitica syntetyzuje wiele czynników wirulencji istotnych na różnych etapach procesu patogenezy. Do czynników wirulencji aktywnych na wczesnych stadiach infekcji należą białka błony zewnętrznej, z których najważniejsze to kodowana chromosomowo: inwazyna Inv i adhezyna Ail oraz kodowana w plazmidzie wirulencji pYV adhezyna YadA. Do pełnej zjadliwości patogenu wymagana jest ponadto aktywność systemu sekrecji III typu Ysc-Yop, który umożliwia pałeczkom Y. enterocolitica wprowadzenie do wnętrza komórek eukariotycznych toksycznych białek Yop. Ważną cechą Y. enterocolitica jest również zdolność syntezy rzęsek, które służą do poruszania się w środowisku, co ułatwia rozprzestrzenianie i zasiedlanie nowych nisz ekologicznych. Y. enterocolitica jest zdolna do kolonizacji różnych nisz ekologicznych zarówno w obrębie organizmu gospodarza, jak i poza nim. Proces adaptacji bakterii do zmieniających się parametrów fizykochemicznych środowiska możliwy jest dzięki funkcjonowaniu różnorodnych mechanizmów regulacyjnych, które dostosowują metabolizm bakterii, a także regulują ekspresję czynników wirulencji w odpowiedzi na różnorodne bodźce, co jest kluczowe dla przebiegu procesu patogenezy i niezbędne do uniknięcia odpowiedzi ze strony układu immunologicznego gospodarza i kolonizacji organizmu. W efektywnym odbiorze i przekazywaniu sygnałów do wnętrza komórki bakteryjnej uczestniczą dwuskładnikowe systemy transdukcji sygnału (TCSs, ang. Two Component Systems), w tym szlak sygnałowy EnvZ/OmpR. W systemie tym transbłonowe białko EnvZ pełni funkcję kinazy sensorowej, która odbierając bodziec ze środowiska podlega autofosforylacji, a następnie grupa fosforanowa przenoszona jest na regulator odpowiedzi, białko OmpR, które ufosforylowane (OmpR-P) wiąże się z DNA i w sposób pozytywny lub negatywny reguluje transkrypcję docelowych genów. Wyniki dotychczasowych badań sugerowały, że system EnvZ/OmpR u Y. enterocolitica, może pełnić różnorodne i często odmienne funkcje od tych opisanych dla niepatogennej Escherichia coli K-12 czy innych enteropatogenów. Celem rozprawy doktorskiej było zbadanie udziału szlaku sygnałowego EnvZ/OmpR w regulacji właściwości wirulentnych oraz zdolności adaptacyjnych Y. enterocolitica O:9. Przeprowadzone analizy dotyczyły w szczególności: określenia roli białka OmpR w kontroli ruchliwości Y. enterocolitica; zbadania zależności między aktywnością dwuskładnikowego systemu EnvZ/OmpR, a zdolnością Y. enterocolitica do adhezji/inwazji oraz tworzenia biofilmu; scharakteryzowania roli OmpR w regulacji wrażliwości komórek na bakteriobójcze działanie surowicy ludzkiej (cytolityczne działanie układu dopełniacza). W pierwszej części pracy analizowano rolę białka OmpR w kontroli ruchliwości Y. enterocolitica. Eksperymenty wykonane z zastosowaniem metod genetycznych, biochemicznych i fizjologicznych, w tym analizy ekspresji wybranych genów regulonu rzęskowego z wykorzystaniem fuzji reporterowych oraz badania opóźnienia tempa migracji kompleksów nukleoproteinowych, przeprowadzone z oczyszczonym białkiem OmpR w fuzji translacyjnej z domeną polihistydynową, wykazały, że OmpR w postaci ufosforylowanej jest pozytywnym regulatorem ekspresji operonu flhDC, kodującego nadrzędny aktywator genów regulonu rzęskowego. Ponadto udowodniono, że donorem reszt fosforanowych w procesie fosforylacji regulatora OmpR może być, obok partnerskiej kinazy EnvZ, niskocząsteczkowy acetylofosforan. W kolejnym etapie prac badano wpływ systemu EnvZ/OmpR na procesy adhezji i inwazji komórek eukariotycznych oraz tworzenie biofilmu. Hipoteza badawcza zakładała, że OmpR-zależna regulacja ruchliwości oraz stwierdzona wcześniej negatywna regulacja ekspresji inwazyny, a być może także inne pozostające pod kontrolą OmpR czynniki, mogą mieć wpływ na oddziaływania komórek Y. enterocolitica z komórkami eukariotycznymi. Prace na liniach komórkowych HEp-2 dowiodły znaczenia zdolności ruchu Y. enterocolitica w ustaleniu kontaktu z komórką eukariotyczną, co może mieć niebagatelne znaczenie in vivo podczas pierwszych etapów procesu patogenezy. Wyniki potwierdziły także, że inwazyna jest czynnikiem odpowiedzialnym za inwazję komórek eukariotycznych oraz pozwoliły na wysnucie hipotezy o roli niezidentyfikowanych dotąd OmpR-zależnych białek w procesie adhezji. Ponadto, jakościowe i ilościowe analizy obrazu ze skaningowego mikroskopu konfokalnego udokumentowały znaczenie EnvZ/OmpR w procesie tworzenia biofilmu. Celem kolejnej części prezentowanej rozprawy doktorskiej było poznanie roli białka OmpR w modulowaniu wrażliwości komórek Y. enterocolitica na bakteriobójcze działanie surowicy ludzkiej (NHS, ang. Normal Human Serum). W celu wyjaśnienia tej kwestii przeprowadzono kompleksowe badania, które polegały na: (i) analizie SDS-PAGE, Western blot oraz fuzji transkrypcyjnych w celu ustalenia roli OmpR w regulacji ekspresji białek błony zewnętrznej: YadA, Ail, OmpX, OmpC; (ii) zastosowaniu mutantów Y. enterocolitica pozbawionych białek OmpR, YadA, Ail, OmpX, OmpC, a także FlhDC (pozytywny regulator biogenezy rzęski), wraz z układami eksperymentalnymi do badania efektu komplementacji oraz supresji mutacji, a także nadekspresji OmpR, w celu określenia udziału analizowanych białek w oporności komórek na NHS; (iii) izolacji oraz identyfikacji lipopolisacharydu (LPS) w celu ustalenia korelacji między zawartością LPS w błonie zewnętrznej a aktywnością OmpR i FlhDC. Przeprowadzone badania wykazały, że OmpR kontrolując poziom/aktywność białek błony zewnętrznej (YadA, Ail, OmpC) moduluje wrażliwość Y. enterocolitica na NHS. Wyniki przedstawione w pracy dowiodły też, że OmpR-zależne zmiany w składzie i strukturze błony zewnętrznej warunkowane syntezą FlhDC oraz LPS mogą determinować wrażliwość Y. enterocolitica na bakteriobójcze działanie surowicy. Podsumowując, wyniki prezentowane w rozprawie doktorskiej znacząco rozszerzyły wiedzę o roli szlaku sygnałowego EnvZ/OmpR w fizjologii Y. enterocolitica i dostarczyły dowodów wskazujących na udział EnvZ/OmpR w regulacji właściwości wirulentnych oraz zdolności adaptacyjnych patogenu.

Y. enterocolitica is a human enteropathogen – the causative agent of yersiniosis, a zoonotic infectious disease producing a variety of clinical symptoms, i.e. intestinal, pseudoappendicular, erythematous and septicaemic. After campylobacteriosis and salmonellosis, yersiniosis is the third most common zoonosis in Europe. Y. enterocolitica produces many virulence factors that are important at different stages of infection. The virulence factors of Y. entercolitica active in the early stages of infection are outer membrane proteins, the most important of which are chromosomally-encoded invasin (Inv) and adhesin Ail, and adhesin YadA, encoded by the virulence plasmid pYV. The full virulence properties of the pathogen are conferred by the Ysc-Yop type III secretion system, which enables the introduction of toxic Yop proteins into eukaryotic cells. Another important feature of Y. enterocolitica is its ability to synthesize flagella that facilitate the spread and colonization of new ecological niches. Y. enterocolitica is able to colonize different ecological niches, both within the host organism and beyond. The adaptation of bacteria to the conditions of the host organism, as well as the external environment, requires the activation of a variety of regulatory mechanisms that adjust the bacterial metabolism and regulate the expression of virulence factors in response to various stimuli. This is crucial for the process of pathogenesis and is necessary to avoid the host's immune response and to colonize the organism. The function of the effective reception and transmission of environmental signals inside the bacterial cell is fulfilled by the two-component signal transduction systems (TCSs), including the signaling pathway EnvZ/OmpR. The transmembrane kinase EnvZ acts as a sensor, which undergoes autophosphorylation on receiving a stimulus from the environment. The phosphate group is then transmitted to the cytoplasmic protein OmpR which represents the response regulator. The phosphorylated OmpR (OmpR-P) binds to DNA and positively or negatively regulates the transcription of a variety of genes. The recent studies indicated that the EnvZ/OmpR system in Y. enterocolitica can serve a variety of functions that are often different from those described in non-pathogenic E. coli K-12 and other enteropathogens. The aim of this dissertation was to investigate the participation of the signaling pathway EnvZ/OmpR in the regulation of virulence properties and the adaptability of Y. enterocolitica O:9. The performed analyses concerned: defining the role of protein OmpR in the motility control of Y. enterocolitica serotype O:9, examining the relationship between the activity of the two-component system EnvZ/OmpR and the adhesion/invasion and biofilm formation abilities of Y. enterocolitica; characterization of the role of OmpR in the regulation of cell sensitivity to human serum bactericidal action. The first part of the research project described in this thesis examined the role of OmpR in the control of Y. enterocolitica motility. Experiments performed using genetic, biochemical and physiological methods, including analysis of the transcription of selected flagellar genes using reporter fusions and electrophoretic mobility shift assays performed with purified His-tagged OmpR protein, showed that the phosphorylated form of OmpR is a positive regulator of the expression of the flhDC operon encoding a master activator of flagellar regulon gene expression. Moreover, it was confirmed that the activating phosphate donor for the response regulator OmpR may be, apart from a partner kinase EnvZ, the low molecular weight phosphodonor – acetyl-P. In the next part of this project, the influence of the EnvZ/OmpR system on the processes of adhesion and invasion of eukaryotic cells and biofilm formation were studied. The working hypothesis assumed that OmpR-dependent regulation of motility and the previously identified negative regulation of invasin, and perhaps other currently uncharacterized factors under the control of OmpR, may affect the interactions of Y. enterocolitica with eukaryotic cells. Experiments conducted on the cell line HEp-2 demonstrated that the motility of Y. enterocolitica is essential in establishing contact with eukaryotic cells, which might have important implications in vivo during the initial stages of pathogenesis. The results of these experiments confirmed the importance of invasin as a factor responsible for the invasion of eukaryotic cells and indicated that other, as yet unidentified, OmpR-dependent proteins also participate in the adhesion process. In addition, by scanning confocal microscopy that gives a simultaneous qualitative and quantitative analysis, the importance of EnvZ/OmpR in biofilm formation was documented. The aim of the final part of this project was to investigate the function of EnvZ/OmpR in modulating the sensitivity of Y. enterocolitica cells to the bactericidal activity of serum. To test this aspect a comprehensive study was conducted consisting of (i) SDS-PAGE analyses, western blotting and the construction of transcriptional fusions to examine OmpR-dependent regulation of the outer membrane proteins YadA, Ail, OmpX and OmpC; (ii) the application of Y. enterocolitica mutants lacking proteins OmpR, YadA, Ail, OmpX, OmpC and FlhDC, with complementation or suppression of these mutations and overexpression of OmpR, to determine the involvement of these proteins in cell resistance to NHS (Normal Human Serum); (iii) analysis of the correlation between the activity of OmpR and FlhDC and the outer membrane lipopolysaccharide (LPS) content. The experimental results indicated that the activity of OmpR determines the contribution of the outer membrane proteins YadA, Ail, and OmpC in conferring resistance to human serum. The results of this study provided also evidence that OmpR-dependent regulation of the sensitivity of Y. enterocolitica to the bactericidal activity of serum depends to some extent on the ability of this regulator to influence the composition/activity of the outer membrane proteins, FlhDC synthesis and LPS content. In conclusion, the results presented in this thesis significantly expanded knowledge about the role of the signaling pathway EnvZ/OmpR in the physiology of Y. enterocolitica and provided evidence that the EnvZ/OmpR system participates in the regulation of virulence properties and the adaptability of this pathogen.