Wpływ podstawników polieterowych na aktywność biologiczną analogów kurkuminy

Zasadniczym celem mojej pracy było otrzymanie rozpuszczalnych w wodzie analogów kurkuminy z hydrofilowymi podstawnikami polieterowymi oraz zbadanie otrzymanych związków podkątem aktywności cytotoksycznej względem komórek nowotworowych i prawidłowych, a także podkątem występowania apoptozy i obecności białek pro- i antyapoptotycznych. Innym celem mojej pracybyła synteza analogów kurkuminy o potencjalnych właściwościach mezogenicznych.Kurkumina ton ależący do polifernoli roślinnych żółty barwnik wyizolowany z korzenia ostryżudługiego Curcuma longa.Kurkumina w komórce gromadzi się głównie w błonie komórkowej, choć w niektórych rodzajachkomórek stwierdza się jej obecność także w obrębie jądra komórkowego [40].Spośród znanych właściwości kurkuminy najważniejsze to aktywność przeciwnowotworowa(indukowanie apoptozy w komórkach nowotworowych, hamowanie przerzutoewania) i chemoprewencja:Dodatkowo kurkumina wykazuje działanie: działanie przeciwzapalne [6, 12-16],przeciwutleniające [4, 6,16-18],immunosupresyjne [13, 16, 19],antymutagenne [20],neuroprotekcyjne, [5, 17, 21-23],solwatowanie toksycznych metali [5, 17, 22-24], oraz przeciwpierwotniakowe .Dodatkowym atutem kurkuminy jako związku o potencjalnym znaczeniu w medycynie jest jejnietoksyczność [13, 24, 25]Wśród wad kurkuminy, które utrudniają jej wykorzystanie w terapii należy wymienić słabąrozpuszczalność w wodzie, a co za tym idzie niską biodostępność oraz szybki metabolizm worganizmie.Celem mojej pracy było zaprojektowanie i synteza serii analogów kurkuminy możliwie dobrzerozpuszczalnych w wodzie oraz bardziej stabilnych w organizmie. Oba warunki wydawały się spełniaćpodstawniki polieterowe. Wzory otrzymanych hydrofilowych analogów kurkuminy zamieściłem narysynku 1-R2R1OR2R1HOR3 R3- Rysunek 1 Polieterowe analogi kurkuminy.3Związek R1 R2 R3kurkumina CH3O- HO- HAnalog1 CH3O(CH2)2O- CH3O(CH2)2O- HAnalog2 CH3O(CH2)2O(CH2)2O- CH3O(CH2)2O(CH2)2O- HAnalog3 CH3O- CH3O(CH2)2O(CH2)2O- HAnalog4 CH3O(CH2)2O(CH2)2O- CH3O- HAnalog5 H- CH3O(CH2)2O(CH2)2O- HAnalog6 CH3O(CH2)2O(CH2)2O- CH3O(CH2)2O(CH2)2O- CH3O(CH2)2O(CH2)2O--Wszystkie otrzymane przez związki nie były dotychczas opisywane w literaturze. W niniejszej pracyzostała zastosowana metoda opracowana przez Pabona [124]. Pochodne aldehydów zostałyzsyntetyzowane metodą Wiliamsona. i metodą Vilsmeiera- Haacka. Zostały też zbadane potencjalnewłaściwości ciekłokrystaliczne otrzymanych analogów kurkuminy.W związku z tym, że żaden z otrzymanych polieterowych analogów kurkuminy z zachowaniemukładu  diketonowego nie wykazywał właściwości ciekłokrystalicznych, celem otrzymaniamezogenicznych analogów kurkuminy otrzymywałem odpowiednie ich pochodne pirazolowe iizoksazolowe z podstawnikami alkoksylowymi .Wzory otrzymanych analogów przedstawia rysunek 2.Struktury otrzymanych związków udowodniono za pomocą widma NMR oraz analizy elementarnej.R1R2R3N NR1R2R3R1R2R3N OR1R2R3a bR1= H; OH; OAlkR2= H; OH; OAlkR3= H; OH; OAlkRysunek 2 . Analogi kurkuminy: pochodna pirazolu (a) oraz izoksazolu (b).)Badania aktywności cytotoksycznej związków wykonałem przy użyciu testu EZ4U. na liniilimfocytarnej prawidłowej (GMM14467) i nowotworowej (HL60) Moje badania potwierdziły, opisywanąw literaturze, istotną rolę grupy metokyslowej dla aktywności cytotoksycznej[12, 127, 137]. Największą4aktywność wykazywał związek, w którym grupa metoksylowa w tym samym miejscu co w kurkuminiezostała zachowana (analog 3). Kryterium wyboru spośród nowych analogów związków bardziejaktywnych od kurkuminy stanowiły: niższa w stosunku do związku referencyjnego wartość IC50 orazwspółczynnik oporności RF (IC50 GM14467//IC50 HL60) > 1Po analizie wyników zamieszczonych w tabeli 1 , można stwierdzić, że obu warunków nie spełniłżaden z badanych analogów. Na podstawie uzyskanych wyników w tej części pracy, można wskazać dwazwiązki wyróżniające się spełnieniem przynajmniej pojedynczych z dwóch wymienionych wyżejwarunków, tj. analog 3, o istotnie większej w porównaniu do kurkuminy aktywności cytotoksycznościwzględem komórek białaczki i analog 6, którego RF wyniósł ok. 1,8 (IC50.GM14467 > 50 μM). Dodalszych badań nad aktywnością biologiczną wybraliśmy analog 3, aby prześledzić porównawczopotencjalne mechanizmy zwiększonej w stosunku do kurkuminy aktywności cytotoksycznej wobeckomórek nowotworowych.W oparciu o przeprowadzone badania można wskazać kierunki dalszych prac nad modyfikacjamicząsteczki kurkuminy, aby uzyskać związek bardziej od niej cytotoksyczny i zarazem selektywnywzględem komórek nowotworowych. .Najbardziej odpowiednimi związkami bazowymi do dalszychmodyfikacji struktury wydają się analog 3 (wykazujący największą aktywność cytotoksyczną) i analog 6(największa selektywność w stosunku do komórek nowotworowych).tj. wprowadzenia formypierścieniowej podstawników polieterowych, z ukierunkowaniem na podstawnik 3,6-dioksoheptylowy(selektywność działania) i pozostawienie grupy metoksylowej w pozycji meta-, (stosunkowo wysokaaktywność cytotoksyczna).Nazwa/numeranaloguGM14667IC50 ± SD [M]HL60IC50 ± SD [M]Kurkumina 28 ± 4 24 ± 11 32 ± 9 > 502 12 ± 1 > 503 9 ± 1 15 ± 24 29 ± 8 26 ± 25 > 50 > 506 > 50 28 ± 07 40 ± 1 > 50Tabela nr.1 Wyznaczone wartości IC50 dla kurkuminy i jej analogówDo badania morfologicznych oznak apoptozy wykorzystałem metodę mikroskopową z użyciembarwnika fluorescencyjnego DAPI. Na podstawie obserwacji mikroskopowych, morfologiczne cechyapoptozy zanotowałem jedynie w hodowlach komórek GM 14467 poddawanych działaniu kurkuminy lubanalogu 3 w stężeniach równych właściwym wartościom IC50...W niniejszej pracy oceniałem stężenie trzech białek apoptotycznych, tj.: antyapoptotycznychBCL-2 i surwiwiny i proapoptotycznego białka BAX. Analiza Western blot wykazała obecność5wszystkich trzech białek w komórkach GM14467, z największym stężeniem białka BCL-2 .Komórkibiałaczkowe HL60 charakteryzowała w tym zakresie jedynie obecność i znaczne stężenie białka BCL-2(Fot. 12).Kurkumina w komórkach GM14467 w stężeniu równym IC50. wyraźnie indukowała pojawieniesię białek, BCL-2 i BAX, Odmienny profil stężeń wspomnianych białek ukształtował się pod wpływemanalogu 3. Stężenie analogu 3 związku równe ½ IC50 jako jedyne okazało się efektywne w indukcji BAX,BCL-2 i surwiwiny. Stężenie związku równe IC50 powodowało jedynie niewielki wzrost stężeniaantyapoptotycznego białka BCL-2.W przypadku komórek HL60 nie zaobserwowałem wyraźnych zmian ekspresji badanych białekani pod wpływem kurkuminy, ani analogu 3.Właściwości ciekłokrystaliczne oznaczałem za pomocą mikroskopu polaryzacyjnego,kalorymetru różnicowego oraz rentgenografu.. Sekwencje fazowe otrzymanych związków przedstawiaponiższa tabela nr 2. Wzory strukturalne otrzymanych analogów znajdują się na Rysunku 2.Niezależnie od obecności czy braku łącznika winylowego pochodne pirazolowe wykazują szerszyzakres faz smektycznych niż pochodne izoksazolowe. Może mieć to związek z możliwością tworzeniamiędzycząsteczkowych wiązań wodorowych przez cząsteczki pirazolu, co prowadzi do dimeryzacji.Tworzenie takich wiązań sprzyja uporządkowaniu środków ciężkości molekuł. Nie ma natomiast wpływuna trwałość faz kolumnowych analogów posiadających po trzy łańcuchy oktyloksylowe w pierścieniacharomatycznych.HHNN NNRRRRRysunek 10 Dimery pirazolowePowyższe wyniki pozwalają zaproponować dalsze kierunki badań nad ciekłokrystalicznymianalogami kurkuminy. Jednym z nich byłoby sprawdzenie czy wydłużenie grup mostkowych o kolejnefragmenty winylowe spowoduje dalszą poprawę właściwości ciekłokrystalicznych analogów kurkuminy.Innym kierunkiem byłaby synteza i badanie tychże właściwości ich kompleksów z kationami metali.Analog Sekwencja fazowaII-1 Cr126.0(9.1) SmC 222.5(0.5) SmA 230.9(4.4) III-4 Colh 37.1(2.5) IIV-1 Cr 123.1(38.1) SmC189.8(2.2) N 209.5(1.6) IIV-4 Colh 34.9(2.6) I6Tabela nr 2. Przejścia fazowe badanych związków, temperatura ºC entalpia (w nawiasach) w kJ/mol, Ioznacza faze izotropowa, SmA –smektyk A, SmC smektyk C, N- nematyk, Colh – fazę kolumnowąheksagonalną, Cr – kryształ. Związki I-4 i III-4 są cieczami w temperaturze pokojowej.