Biofizyczne podstawy molekularnego mechanizmu wiązania 5' końca kwasu rybonukleinowego przez białko degradujące DcpS

Obiektem badań opisanych w rozprawie doktorskiej jest białko rozkładające informacyjny kwas rybonukleinowy (mRNA), Decapping Scavenger (DcpS). Jego komórkową funkcją jest hydroliza końca 5' mRNA w ostatnich etapach degradacji krótkich oligonukleotydowych fragmentów. Poznana struktura krystalograficzna dimeru białka (o cząsteczkowej masie monomeru 40·103 j.m.a.) nie dawała odpowiedzi na pytania o molekularny mechanizm działania. W przedstawionych badaniach określono mechanizm wiązania końca 5' mRNA (kapu) i specyfikę hydrolizy enzymatycznej, a także wyznaczono powinowactwo do szerokiej klasy syntetycznych analogów kapu mających potencjalne zastosowanie terapeutyczne. Różne modyfikacje chemiczne w obrębie struktury badanych związków przełożyły się na dokładny obraz tworzonych oddziaływań i specyfiki miejsca aktywnego białka DcpS. Uzyskano parametry termodynamiczne wiązania kapu przez DcpS, również w zestawieniu z najlepiej poznanym białkiem wiążącym kap- czynnikiem inicjującym translację eIF4E. Zastosowano szereg wzajemnie się uzupełniających metod biofizycznych: kalorymetrię, spektroskopię absorpcyjną, fluorescencyjną (stacjonarną i czasowo rozdzielczą) oraz dichroizmu kołowego. Duża część badań eksperymentalnych ma charakter pionierski. Po raz pierwszy zastosowano izotermiczne miareczkowanie kalorymetryczne do określenia stechiometrii układu białko-kap, a do obserwacji zmian strukturalnych białka użyto spektroskopii dichroizmu kołowego w bliskim nadfiolecie. Eksperymenty z zastosowaniem znakowanych fluorescencyjnie analogów końca 5' mRNA otworzyły możliwości stosowania nowych technik badania oddziaływania kapu z białkami.

The research described in the PhD thesis is focused on a protein that degrades messenger ribonucleic acid (mRNA) – the Decapping Scavenger (DcpS). The protein’s cellular role is to hydrolyze the mRNA 5’ end during the last stages of degradation of short oligonucleotide fragments. The known crystallographic structure of the protein dimer (molecular mass of a monomer is 40·103 u) did not answer the questions on the molecular mechanism of action. In the presented research, the mechanism of mRNA 5’ end binding was determined, as well as specificity of enzymatic hydrolysis; also, affinity towards a wide class of synthetic cap analogs with potential therapeutic application was found. Different chemical modifications within the structure of the studied compounds allowed a precise image of the molecular interactions and specificity of the DcpS active site to be determined. Thermodynamic parameters of cap binding by DcpS were obtained, also is comparison to the best-known cap-binding protein, translation initiating factor eIF4E. A range of complementary biophysical methods was used: calorimetry, absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy (both, steady-state and time-resolved) and circular dichroism spectroscopy. A large part of the experimental studies is innovative. For the first time, isothermal titration calorimetry was used to determine the stoichiometry of the protein-cap system, and circular dichroism in near-UV range was used to study structural changes within the protein. The experiments with use of fluorescently labeled mRNA 5' end analogs opened the possibility to use new techniques for studying interaction between cap and proteins.