Zastosowanie wybranych metod fizyki i biologii molekularnej w badaniach struktury i oddziaływań białek z rodziny DcpS

Obiektem badań opisanych w rozprawie doktorskiej jest białko DcpS (ang. Decapping Scavenger), które bierze udział w degradacji struktury (tzw.kapu) znajdującej się na 5’ końcu informacyjnego kwasu rybonukleinowego (mRNA). Hydroliza końca 5’ mRNA przez enzym DcpS w obrębie krótkich oligonukleotydów chroni komórkę przed akumulacją cząsteczek kapu, której konsekwencją może być inhibicja procesów takich jak: biosynteza białek na matrycy mRNA czy dojrzewanie pre-mRNA. Zaburzenia związane z dysfunkcją komponentów zaangażowanych w metabolizm mRNA (w tym enzymu DcpS) u człowieka mogą być przyczyną m.in. chorób układu nerwowego, sercowo-naczyniowego a nawet nowotworów. Eksperymenty zaprezentowane w rozprawie zostały wykonane na białkach DcpS pochodzących z H.sapiens (człowiek), C. elegans (nicień wolno żyjący) oraz A. suum (nicień pasożytniczy – glista świńska). Wyniki eksperymentalne opisane w rozprawie zostały podzielone na dwie części. Pierwsza dotyczyła przygotowania odpowiedniego konstruktu bakteryjnego do „produkcji” białek DcpS w hodowlach bakteryjnych. W tej części analizowałam wpływ lokalizacji etykiety złożonej z sekwencji 6-10 histydyn (służącej do oczyszczania białka metodą chromatografii metalopowinowactwa) na N- lub C- końcu białka DcpS z H.sapiens, C.elegans oraz A.suum na strukturę, stabilność oraz właściwości hydrolityczne. Moje wyniki potwierdziły, że sekwencja polihistydynowa nie wpływa znacząco na aktywność, termostabilność oraz strukturę drugorzędową białek DcpS. Otrzymane różnice np.: dwukrotny wzrost aktywności enzymu lub przesunięcie o 1°C temperatury topnienia w porównaniu z białkiem natywnym (brak etykiety histydynowej), można raczej rozpatrywać pod kątem tendencji do zmian w pewnych kierunkach. Wyjaśniłam także wątpliwość dotyczącą specyficzności substratowej enzymu DcpS wobec cząsteczki m7GDP w kontekście lokalizacji etykiety w białku, która w literaturze nie została opisana w sposób jednoznaczny. W literaturze brak jest informacji na temat stabilności temperaturowej białek DcpS oraz mechanizmów ich agregacji. Postanowiłam zatem wykorzystać tę lukę i podjąć próbę charakterystyki enzymów DcpS pod tym kątem. Naukowcy od dawna badają wpływ czynników stresowych jak: temperatura czy obecność denaturanta (w moich badaniach był to chlorowodorek guanidyny) na trwałość struktur białkowych. Paradoksalnie, śledzenie procesu denaturacji, a więc niszczenia struktury białka, pozwala lepiej poznać i zrozumieć nie tylko mechanizmy ewentualnej agregacji, ale także oddziaływania kluczowe w procesie fałdowania białka do specyficznej dla niego konformacji oraz istotne dla stabilizacji tej struktury. Przeprowadzone przeze mnie eksperymenty wykazały, że białka DcpS z człowieka oraz nicieni inkubowane w stałej temperaturze 37°C wraz z upływem czasu tworzą agregaty o morfologii i strukturze drugorzędowej charakterystycznej dla amyloidów. Istotnym krokiem dla mojej pracy okazało się włączenie do badań ludzkiego białka DcpS z mutacją, które wykazało silniejszą tendencję do agregacji w stosunku do ludzkiego białka w formie natywnej. Mechanizm agregacji białek DcpS okazał się tematem trudnym do ustalenia. Denaturacja termiczna oraz chemiczna wskazała jej przypuszczalne ścieżki, gdzie jednym z etapów jest prawdopodobnie separacja faz i formowanie białkowych kondensatów. Otrzymane wyniki stanowią pierwsze doniesienia w tematyce agregacji białek DcpS. Trudno jest na chwilę obecną określić, czy formowane przez enzym DcpS włókna mają charakter funkcjonalny czy patologiczny oraz czy ich obecność w eksperymentach in vitro potwierdzi się in vivo w komórkach. Zaprezentowane wyniki mogą posłużyć jako punkt wyjścia do dalszych badań i rozważań na ten temat.

The object of my research described in the doctoral thesis is the DcpS protein (Decapping Scavenger), which is involved in the degradation of the structure (the so-called cap) located at the 5 'end of the messenger ribonucleic acid (mRNA). Hydrolysis of the 5 'end of mRNA by the DcpS enzyme within short oligonucleotides protects the cell from the accumulation of cap molecules, which can result in inhibition of processes such as protein biosynthesis on the mRNA template or pre-mRNA maturation. Disorders associated with dysfunction of components involved in mRNA metabolism (including the DcpS enzyme) in humans can cause, among others, diseases of the nervous system, cardiovascular system and even cancer. The experiments presented in the these were performed on DcpS proteins derived from H.sapiens (human), C. elegans (free-living nematode) and A. suum (parasitic nematode - pig roundworm). The experimental results described in the dissertation were divided into two parts. The first concerned the preparation of a suitable bacterial construct for the “production” of DcpS proteins in bacterial cultures. In this part, I analyzed the effect of the localization of a label consisting of a sequence of 6-10 histidines (used to purify the protein by metal-affinity chromatography) at the N- or C-end of the DcpS protein from H.sapiens, C.elegans and A.suum on the structure, stability and hydrolytic properties. My results confirmed that the polyhistidine sequence does not significantly affect the activity, thermostability and secondary structure of DcpS proteins. The obtained differences, e.g. a twofold increase in enzyme activity or a shift of 1°C in the melting temperature compared to the native protein (no histidine label), can rather be considered in terms of tendencies to change in certain directions. I also explained the doubt regarding the substrate specificity of the DcpS enzyme for the m7GDP molecule in the context of the label localization in the protein, which was not described unambiguously in the literature. There is no information in the literature about thermal stability of DcpS proteins and the mechanisms of their aggregation. I decided to explore this gap and characterize DcpS enzymes. Scientists are studying the effects of stress factors like temperature or the presence of a denaturant, which in my study was guanidine hydrochloride, on the stability of protein structures. Paradoxically, following the process of denaturation, i.e. the destruction of the protein structure, allows us to better know and understand not only the mechanisms of eventual aggregation, but also the interactions that are crucial in the process of folding the protein to its specific conformation and important for the stabilization of this structure. My experiments showed that DcpS proteins from humans and nematodes incubated at a constant temperature of 37°C form aggregates with morphology and secondary structure characteristic of amyloids. An important step for my work was to include human DcpS protein with a mutation in the study, which showed a stronger tendency to aggregate compared to human protein in its native form. The mechanism of aggregation of DcpS proteins turned out to be a extremely challenging topic to determine. Thermal and chemical denaturation indicated its probable paths, where one of the stages is probably phase separation and formation of protein condensates. All obtained results are the first reported studied on aggregation of DcpS proteins. It is difficult to determine at the moment whether the fibers formed by the DcpS enzyme have a functional or pathological character and whether their presence in in vitro experiments will be confirmed in vivo in cells. The results obtained are a solid starting point for further research and considerations on this topic.