Role of B cells in the generation of thymus-derived regulatory T cells

Pochodzące z grasicy, naturalne limfocyty T regulatorowe (tTregs, thymusderived regulatory T cells, lub nTregs, natural regulatory T cells), charakteryzujące się fenotypem CD4+CD25+Foxp3+, mają istotne znaczenie dla działania układu odpornościowego ze względu na ich zdolność do hamowania fizjologicznej i patologicznej odpowiedzi immunologicznej oraz kontrolowania odpowiedzi na antygeny własne. Z tego powodu Tregs pochodzące z grasicy odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu tolerancji na antygeny własne i homeostazy układu odpornościowego. Limfocyty te powstają w grasicy, po czym migrują do obwodowych narządów limfoidalnych, gdzie podejmują swoje funkcje. Ich rozwój i aktywacja zależą od interakcji z komórkami prezentującymi antygen (APCs, antigenpresenting cells), głównie komórkami dendrytycznymi (DCs, dendritic cells). Rolę APC mogą pełnić również limfocyty B ze względu na powierzchniową ekspresję MHC II i zdolność do pobierania, przetwarzania i prezentacji antygenów limfocytom T CD4+. Celem badań przedstawionych w tej dysertacji była ocena zdolności mysich limfocytów B użytych w roli komórek prezentujących antygen do indukowania rozwoju Treg pochodzenia grasiczego w modelu in vitro, w którym wykorzystano opracowany na podstawie wcześniejszych badań model hodowli całej populacji tymocytów, zawierającej również komórki prekursorowe Treg, z limfocytami B izolowanymi ze śledziony. Znając rolę, jaką pełnią komórki dendrytyczne w różnicowaniu regulatorowych limfocytów T o fenotypie CD4+CD25+Foxp3+ w obwodowych narządach limfoidalnych i w grasicy, zbadano rolę MHC II i cząsteczek kostymulatorowych (CD80, CD86, CD40) aktywowanych limfocytów B na generowanie Treg pochodzenia grasiczego. W celu aktywacji limfocytów B przez receptory TLR7 i TLR4 zastosowano imikwimod (IMQ, Imiquimod) i lipopolisacharyd (LPS). W grasicy naturalnie występuje niewielka populacja limfocytów B, której rola w rozwoju tymocytów, a szczególnie limfocytów T regulatorowych jest mało znana. W niniejszej dysertacji przedstawiono wstępną analizę roli grasiczych limfocytów B w rozwoju nTreg. Ponadto, zbadano rolę glukokortykoidów uznawanych za czynnik selekcyjny w powstawaniu limfocytów T CD4+CD25+Foxp3+ w warunkach hodowli zastosowanych w badaniach. Powszechnie uważa się, że glukokortykoidy, charakteryzujące się silnym działaniem immunosupresyjnym, hamują dojrzewanie komórek dendrytycznych, prezentujących antygen zmniejszając ekspresję MHC II i cząsteczek kostymulatorowych, co w konsekwencji prowadzi do stanu, w którym komórki te częściej indukują tolerancję na antygeny. W badaniach zastosowano syntetyczny glukokortykoid, deksametazon (Dex, dexamethasone). Wyniki badań prezentowanych w dysertacji podzielone zostały na trzy części: pierwsza część dotyczy roli śledzionowych limfocytów B w rozwoju Treg pochodzących z grasicy, w drugiej przedstawiono wstępne wyniki dotyczące roli grasiczych limfocytów B w generowaniu nTreg, a w trzeciej opisano wpływ Dex na powstawanie nTreg w hodowli tymocytów z limfocytami B śledziony. Wyniki badań prezentowanych w pierwszej części wskazują na zwiększenie odsetka limfocytów B śledziony wykazujących ekspresję MHC II i cząsteczek kostymulatorowych (CD80, CD86, CD40) pod wpływem aktywacji. Jednocześnie zwiększeniu ulega ekspresja większości tych białek. W hodowli tymocytów z limfocytami B obserwowano zmianę rozkładu głównych populacji tymocytów, dotyczącą przede wszystkim tymocytów DN CD4–CD8– i DP CD4+CD8+ z małymi różnicami w odsetkach SP CD4+CD8– i CD8+CD4– niezależnie od stosunku tymocytów do limfocytów B i aktywacji limfocytów B. W środowisku hodowli tymocytów i limfocytów B śledziony wykazano zwiększenie odsetka tymocytów SP CD4+Foxp3+. Zjawisko to zależne było od aktywacji limfocytów B i stosunku tymocytów do limfocytów B w hodowli. Wykazano, że limfocyty B śledziony mają zdolność to generowania regulatorowych limfocytów T pochodzenia grasiczego in vitro zależnie od siły sygnałów kostymulatorowych przekazywanych różnicującym się tymocytom. Ponadto, w środowisku aktywowanych limfocytów B śledziony obserwowano zwiększenie ekspresji czynnika transkrypcyjnego Foxp3 w powstałych limfocytach T regulatorowych. Wykazano, że izolowane z hodowli in vitro tymocyty o fenotypie CD4+CD25+Foxp3+ wykazują aktywność supresorową w teście hamowania proliferacji aktywowanych docelowych limfocytów T CD4+. Blokowanie cząsteczek kostymulatorowych i MHC II na limfocytach B wykazało, że CD80/CD86 są skuteczniejsze niż CD40 w procesie generowania nTreg przez limfocyty B, co wskazuje na większe zaangażowanie w ten proces interakcji cząsteczek CD80/CD86 z CD28 niż CD40/CD40L. Rola grasiczych limfocytów B w powstawaniu nTreg in vitro została zaprezentowana w drugiej części rozprawy. Wyniki 72-godzinnej hodowli wskazują, że aktywowane grasicze limfocyty B utrzymują populację nTreg niezależnie od zastosowanego aktywatora (LPS lub IMQ) i przeciwdziałają zmniejszeniu odsetka nTreg, który obserwowano w hodowli niestymulowanej aktywatorami. Wyniki badań pokazują, że grasicze i śledzionowe limfocyty B różnią się od siebie pod względem właściwości po aktywacji i ich roli w indukowaniu rozwoju Treg. Dodatkowo, aktywacja limfocytów B występujących naturalnie w grasicy przez LPS lub IMQ powoduje 2-3-krotne zwiększenie liczby grasiczych limfocytów B po 72 godzinach hodowli w porównaniu z hodowlą 24-godzinną. Te obserwacje pozwalają nam wnioskować, że grasicze limfocyty B wpływają na utrzymanie żywotności lub powstawanie nTreg w sposób zależny od aktywacji limfocytów B i ich proporcji w stosunku do tymocytów. Dodatkowo, interakcja aktywowanych limfocytów B grasicy z tymocytami skutkowała zwiększeniem ekspresji Foxp3 tymocytów o fenotypie SP CD4+Foxp3+. Celem badań prezentowanych w trzeciej części dysertacji było zbadanie zdolności deksametazonu do zwiększenia tolerogenności limfocytów B i w rezultacie do wzrostu odsetka powstających w hodowli nTreg. Przedstawione wyniki wskazują, że w warunkach hodowli limfocytów B śledziony i tymocytów deksametazon nie wykazuje aktywności czynnika selekcyjnego w powstawaniu nTreg.

The importance of natural regulatory T cells (nTregs) characterized by CD4+CD25+Foxp3+ phenotype lies in their ability to suppress pathological and physiological immune response, and control the responsiveness to self-antigens. Thus, nTregs have a pivotal role in the maintenance of self-tolerance and immune homeostasis. They are developed in the thymus and migrate to peripheral lymphoid organs to exert their suppressive function. Their development and activation is dependent on the interaction with antigen-presenting cells (APCs), mainly dendritic cells. B cells can also play a role of APC because of their high constitutive expression of MHC II and the ability to uptake, process and present antigens to CD4+ T cells. The aim of the studies presented in this dissertation was to examine the potential of mouse B cells as APC in the generation of thymus-derived nTregs in an in vitro model of co-culture of thymocytes containing nTreg precursors with splenic B cells. Mirroring the role of dendritic cell maturation stage in the differentiation of induced CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in lymphoid organs and nTregs in the thymus, we decided to investigate the impact of MHC II and co-stimulatory molecules (CD80, CD86, CD40) expression on B cells upon activation. Imiquimod (IMQ) and lipopolysaccharide (LPS) were used to activate B cells through TLR7 and TLR4, respectively. In addition to (thymic DC and epithelial cell) a small population of B cells can be found in the thymus. Here the role of thymic B cells in the development of nTregs is discussed based on the results of preliminary studies. It is generally accepted that glucocorticoids acting, mainly as immunosuppressive agents, influence dendritic cells maturation by inhibiting the expression of MHC II and co-stimulatory molecules and maintaining the tolerogenic state of antigen-presenting cells. The impact of a synthetic glucocorticoid, dexamethasone (Dex) to induce tolerogenic B cells and to influence the potential of B cells to induce nTreg generation was investigated. The results of the studies presented in this dissertation are divided into three sections; the first section is related to the role of splenic B cells in thymus-derived regulatory T cells development, the second section is focused on the role of thymic B cells in the development of nTregs, and the third section describes the effect of dexamethasone on the generation of nTregs in the co-culture of thymocytes and splenic B cells. The results of the study presented in the first section demonstrated that LPS- and IMQactivated splenic B cells upregulate the expression of MHC II and co-stimulatory molecules that are essential for the presentation of antigens. Both TLR4 and TLR7 activation increased the percentage of B cells positive for particular molecules or their expression facilitating B cells to interact with CD4+ T cells. Co-culture of thymocytes with splenic B cells changed the pattern of the distribution of the main thymocyte subsets mainly DN CD4–CD8– and DP CD4+CD8+ with minor differences in the percentage of SP CD4+CD8– and CD8+CD4– independently on thymocytes : B cells ratio and B cell activation. However, in the microenvironment influenced by the presence of B cells the percentage of SP CD4+Foxp3+ thymocytes was increased. This phenomenon was dependent on the activation of B cells and thymocytes : B cells ratio. Thus, splenic B cells demonstrated the potential to generate nTregs in vitro dependently on the strength of co-stimulatory signals provided to developing thymocytes. In addition, the presence of splenic B cells resulted in the increase of Foxp3 transcription factor expression. The biological activity of nTregs generated in this study was investigated. It was demonstrated that nTregs isolated from cultures maintained under different conditions statistically decreased the percentage of proliferating, activated, responder CD4+ T cells. Blockade of co-stimulatory molecules and MHC II on B cells revealed that the implication of CD80/CD86 and MHC II molecules was more efficient than CD40 molecule in the process of nTreg generation by B cells indicating to the importance of engagement of CD80/CD86 with CD28 molecule, while the engagement of CD40/CD40L is less important in this process. The role of thymic B cells in the generation of nTregs in vitro was presented in the second section. The results of 72 hours of culture revealed that activated thymic B cells maintained the level of nTreg generation independently of the activator used (LPS or IMQ), or counteracted the decrease of these cells observed in non-activated culture. The results revealed that thymic B cells differ from splenic B cells by their characteristics upon activation; in addition, activation by high concentration of LPS (LPS high), or low concentration of imiquimod (IMQ low) induced the increase of thymic B cells about 2-3-fold after 72 hours of culture compared to 24 hours of culture. This observation allows us to conclude that thymic B cells and splenic B cells influence the generation of nTreg in different ways. In addition, the activated cultures showed increased expression of Foxp3 transcription factor. The aim of the studies presented in the third section was to investigate the potential of Dex to render B cells tolerogenic and in consequence to facilitate the generation of nTregs. The results presented in this section showed that Dex induced the decrease of percentage of positive B cells for co-stimulatory molecules as well as for MHC II. Dex did not change the distribution of thymocyte subsets nor did it influence the generation of thymus-derived nTreg cells.