Rearrangements within the catalytic center of the spliceosome affect pre-mRNA splicing

Splicing pre-mRNA to proces, który prowadzi do wycięcia sekwencji niekodujących (intronów) i połączenia ze sobą sekwencji kodujących (egzonów). Proces ten jest przeprowadzany przez spliceosom, jedną z najbardziej skomplikowanych maszyn makromolekularnych w komórce eukariotycznej, która katalizuje dwie reakcje transestryfikacji. Wieloletnie badania z zakresu biochemii i genetyki w połączeniu z najnowszymi metodami krioelektromikroskopii (cryo-EM) pozwoliły na szczegółowe poznanie mechanizmu splicingu. Pomimo, że spliceosom podlega dynamicznym zmianom w cyklu splicingu, katalityczne centrum RNA pozostaje niezmienione we wszystkich obecnych strukturach zwizualizowanych przez cryo-EM. Moje badania pokazują istnienie dwóch zmieniających się struktur U6 snRNA wewnątrz centrum katalitycznego spliceosomu: nietrwałej, katalitycznie aktywnej oraz stabilnej, katalitycznie nieaktywnej. Oba etapy splicingu zachodzą w tym samym centrum katalitycznym, składającym się z cząsteczek U2 i U6 snRNA, które tworzą katalityczną strukturę tripleksu. Zmiany w centrum katalitycznym podczas przejścia między dwoma etapami splicingu są wspomagane przez ATPazę Prp16, która umożliwia przemieszczenie substratu. Wykorzystując zmutowane allele prp16 jako markery specyficzne dla danego etapu, zostały genetycznie zmapowane mutacje w centrum katalitycznym drożdżowego U6 snRNA, które modulują zmiany konformacyjne między dwoma etapami katalitycznymi. Na podstawie interakcji genetycznych zauważyliśmy, że nie tylko katalityczny tripleks, ale także wewnątrzcząsteczkowa struktura pętli U6 (U6-ISL) są niezbędnymi elementami centrum katalitycznego spliceosomu. Wykazano, że struktura U6-ISL istnieje w dwóch konkurujących stanach, zmieniając się między stabilną, niekatalityczną i niestabilną, przejściową, katalityczną konformacją. Destabilizacja dolnej helisy U6-ISL wspomaga katalizę, podczas gdy jej stabilizacja ułatwia wyjście z konformacji katalitycznej, która jest obrazowana w strukturach cryo EM. Proponowany mechanizm U6-ISL wydaje się być uniwersalny, ponieważ względna elastyczność dolnej helisy U6-ISL jest zachowana u wszystkich eukariontów, a także w U6atac i domenie V intronów grupy II. Zakładamy, że pojedyncze mutacje punktowe zmieniają stabilność U6-ISL, pozwalając na modulację dokładności splicingu. Ponadto sugerujemy, że takie manipulacje genetyczne można wykorzystać do przygotowania preparatów kompleksów spliceosomu odpowiednich do wizualizacji struktury katalitycznej metodą cryo-EM. Ponieważ U6 snRNA paruje z miejscem splicingowym 5′ (5′SS) i pozycjonuje je do katalizy, zbadaliśmy jego rolę w centrum katalitycznym spliceosomu. Skoncentrowaliśmy się na regionie U6 snRNA powyżej motywu ACAGA, gdzie zidentyfikowane allele niwelują defekty mutacji prp16-302 i tym samym destabilizują konformację pierwszego etapu. Przeprowadzo0na została selekcję genetyczną na mutację w białkach Cwc2 i Prp8 w celu sprawdzenia ich zaangażowania w etap splicingu, na którym działa Prp16. Rozkład zidentyfikowanych alleli prp8 i cwc2 wskazuje, że razem z mutantami U6 te czynniki tworzą ścisłą klamrę stabilizującą 5′SS w centrum katalitycznym. Podsumowując, praca ta wykazała znaczące zmiany w U6 snRNA wpływające na katalizę splicingu a także scharakteryzowała dodatkowe interakcje między składnikami spliceosomu Prp8 i Cwc2, które oddziałują z sekwencjami intronu flankującymi 5′SS, stabilizując je w konformacji pierwszego etapu.

Pre-mRNA splicing is a process that removes intervening sequences (introns) from pre-mRNA and joins together the flanking sequences (exons). This process is carried out by the spliceosome, one of the most complicated macromolecular machines in the eukaryotic cell, which catalyzes two transesterification reactions. Decades of biochemical and genetic studies combined with recent cryo-EM structural analysis of the spliceosome have produced a detailed view of the mechanism of splicing. Although it was shown that the spliceosome undergoes dynamic changes during the splicing cycle, the RNA catalytic core remains unchanged in all current structures visualized by cryo-EM. However, I demonstrate that the spliceosomal catalytic center toggles between catalytic and non-catalytic states. Both steps of splicing occur at the same spliceosomal catalytic center, composed of U2 and U6 snRNAs, which form an essential catalytic triplex structure. Rearrangements of the catalytic core during the transition between the two splicing steps are facilitated by an ATPase Prp16, promoting substrate repositioning. Using defective alleles of prp16 as stage-specific markers, we genetically mapped mutations within the core of yeast U6 snRNA that modulate conformational changes between the two catalytic steps. Based on genetic interactions, it was noticed that not only the catalytic triplex but also U6 internal stem loop (ISL) are the necessary components of the spliceosomal catalytic center. This study describes that U6-ISL structure exists in two competing states, changing between stable, non-catalytic, and unstable, transient, catalytic conformations. Destabilization of the lower ISL stem promotes catalysis, whereas its stabilization supports exit from the catalytic conformation that is captured in cryo-EM structures. The proposed mechanism of U6-ISL function appears to be general, as the relative flexibility of the lower U6-ISL stem is conserved across all eukaryotes and is also found in U6atac and domain V of group II introns. We propose that the single point mutations change the stability of the U6-ISL resulting in the modulation of splicing fidelity. Moreover, we suggested that such genetic manipulations can be used to prepare spliceosomal complexes suitable for visualization of the catalytic structure by cryo-EM. Since U6 snRNA base-pairs to the 5′ splice site (5′SS) of pre-mRNA and positions it for catalysis, I further investigated its role at the spliceosomal catalytic center. This study focused on U6 snRNA region upstream of the ACAGA motif, where identified alleles suppress defects of prp16-302 and thus destabilize the first step conformation. Genetic screens were carried out for mutants in the adjacent Cwc2 and Prp8 proteins that may contribute to the same event of Prp16 action. Distribution of the identified prp8 and cwc2 alleles indicates that together with U6 mutants, these three factors form a tight clamp stabilizing the 5′SS at the catalytic center. Together this work identified significant U6 snRNAs changes that affect splicing catalysis and characterized its additional interactions between the spliceosomal components Prp8 and Cwc2 that contact intron sequences to stabilize the 5′SS it in the first step conformation.