Determinacja losu komórek i udział białek powierzchniowych w powstawaniu pierwotnej endodermy w przedimplantacyjnym zarodku myszy

W czasie rozwoju przedimplantacyjnego zarodka myszy powstają trzy linie komórkowe: trofektoderma (TE), epiblast (Epi) i pierwotna endoderma (PE). W dalszym rozwoju zarodka linia TE bierze udział w tworzeniu zarodkowej części łożyska i umożliwia implantację zarodka w macicy. Z linii Epi powstają wszystkie tkanki ciała płodu i większość błon płodowych, a komórki linii PE biorą udział w tworzeniu błony płodowej – pęcherzyka żółtkowego. Komórki PE pełnią też rolę w ustalaniu osi przodo-tylnej zarodka w stadium cylindra zarodkowego. Pierwszy etap różnicowania komórkowego zachodzi w zarodku 16-komórkowym, w którym powstają komórki wewnętrzne i zewnętrzne. W dalszym rozwoju, w trakcie powstawania blastocysty, komórki zewnętrzne zarodka różnicują w pierwszą pozazarodkową linię komórkową – TE. W tym czasie w zarodku powstaje jama, która spycha komórki wewnętrzne w jeden koniec, gdzie tworzą one węzeł zarodkowy (ICM). Na tym etapie rozwoju zarodka komórki ICM zachowują pluripotencję. Nie są one jednakowe, bowiem ICM tworzą komórki prekursorowe Epi i PE, ułożone mozaikowo i różniące się ekspresją genów specyficznych dla tych dwóch linii. Tuż przed implantacją zarodka dochodzi do segregacji komórek Epi i PE. PE tworzy się jako pojedyncza warstwa komórek na zwróconej do jamy blastocysty powierzchni ICM, natomiast Epi zbudowany jest z komórek, które leżą pomiędzy PE i TE. W ten sposób dochodzi do kolejnego etapu różnicowania, w wyniku którego w obrębie węzła zarodkowego powstaje linia pluripotentna – Epi i druga po TE linia pozazarodkowa – PE. W pierwszym etapie moich badań podjęłam się sprawdzenia, kiedy ostatecznie determinowany jest los komórek ICM. Wykorzystując technikę filmowania poklatkowego sprawdziłam w węzłach zarodkowych wyizolowanych z wczesnych oraz późnych blastocyst, kiedy komórki ICM tracą plastyczność rozwojową. Wykazałam, że ostateczna decyzja o różnicowaniu komórek prekursorowych Epi podejmowana jest stopniowo, przy czym większość komórek tej linii ulega determinacji do stadium 4,5-dniowej blastocysty. W tym czasie jednak pojedyncze komórki PE, a także pojedyncze komórki Epi pozostają niezdeterminowane w tworzeniu tych linii i aż do końca 5. dnia rozwoju mogą ulec przeprogramowaniu. W drugiej części moich badań sprawdzałam, czy białka powierzchniowe komórek ICM regulują różnicowanie PE. Badania te przeprowadziłam z wykorzystaniem zarodkowych komórek macierzystych (komórki ES), będących modelem komórek ICM. Wiadomo, że działanie kwasu retinowego (RA) w określonym stężeniu powoduje różnicowanie tych komórek w kierunku PE. Tak zróżnicowane komórki wstrzykiwałam do zarodka myszy w stadium blastocysty i stwierdziłam, że ich komórki potomne lokalizowały się wyłącznie w PE, podczas gdy niezróżnicowane komórki ES wbudowywały się tylko w Epi. Zaobserwowałam, że białka adhezyjne kadheryna E i Pecam-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule) zanikają we wczesnych etapach różnicowania komórek ES w kierunku PE. Dlatego podjęłam próbę określenia czy białka te regulują powstawanie PE w blastocyście. Wiadomo, że we wczesnych blastocystach Pecam-1 wykrywane jest we wszystkich komórkach ICM, a po wyodrębnieniu warstw Epi i PE jego obecność ograniczona jest tylko do komórek Epi. Sprawdziłam, czy brak Pecam-1 w komórkach ES spowoduje preferencyjne tworzenie przez nie PE w blastocyście. Wykorzystując siRNA przeciwko Pecam-1 obniżyłam ilość tego białka w komórkach ES, które następnie wstrzykiwałam do zarodków 8 komórkowych oraz do blastocyst. Stwierdziłam, że tak zmodyfikowane komórki ES nie różnicują w kierunku PE, ale podobnie jak niezmodyfikowane komórki kontrolne, integrują się z Epi. Oznacza to, że brak białka Pecam-1 nie sprzyja różnicowaniu komórek ES w PE. Podjęłam się także zbadania lokalizacji kadheryny E w komórkach blastocysty oraz sprawdzenia jej roli w tworzeniu PE. Wykazałam, że we wczesnych blastocystach poziom kadheryny E pomiędzy komórkami prekursorowymi PE oraz EPI jest podobny. Natomiast w późnych blastocystach pomiędzy komórkami PE jest mniej kadheryny E niż pomiędzy komórkami EPI. Wykazałam, że w komórkach PE, które znajdują się na powierzchni ICM, lokalizacja kadheryny E jest spolaryzowana – brak jej w apikalnej części błony, a jest obecna w jej części bocznej i podstawnej. Dodatkowo, zaobserwowałam jądrową lokalizację kadheryny E w komórkach PE, co może mieć znaczenie w ochronie komórek tej linii przed apoptozą. Wykazałam, że po segregacji komórek ICM, ilość mRNA kadheryny E w komórkach linii PE jest mniejsza niż w komórkach Epi. Zatem poziom kadheryny E podczas segregacji komórek ICM jest regulowany na poziomie transkrypcji. Zbadałam również wpływ obniżenia poziomu kadheryny E (przy użyciu dsRNA) na kierunek różnicowania blastomerów. Nie zaobserwowałam jednak preferencyjnej lokalizacji komórek wywodzących się z blastomerów z obniżoną ilością kadheryny E. Wchodzą one w skład wszystkich trzech linii komórkowych blastocysty, z tylko nieco większą częstością do linii TE, niż dzieje się to w przypadku blastomerów z normalnym poziomem kadheryny E. Wynik ten może sugerować, że zmiany poziomu kadheryny E nie są bezpośrednio odpowiedzialne za różnicowanie PE. Sprawdziłam także, że w moim układzie doświadczalnym brak kadheryny E nie był kompensowany ekspresją kadheryny N. Obniżona ilość kadheryny E, przy jednoczesnej obecności kadheryny N, wimentyny oraz białka Snail są cechami procesu EMT (ang. epithelial – mesenchymal transition). Tuż po implantacji blastocysty PE rozprzestrzenia się po wewnętrznej stronie TE. Dlatego też sugeruje się, że w powstawanie PE zaangażowany jest proces EMT. Zaobserwowałam, że wimentyna nie jest obecna we wczesnych blastocystach, ale pojawia się w komórkach PE w późnych blastocystach, w stadium okołoimplantacyjnym. Po implantacji, 5,5 dnia rozwoju nie stwierdziłam już obecności wimentyny w zarodkach. Kadheryny N nie zaobserwowałam w żadnym z badanych przeze mnie stadiów rozwoju zarodka. Wykazałam natomiast, że zarówno we wczesnych, jak i późnych blastocystach w jądrach komórkowych komórek ICM obecny jest czynnik transkrypcyjny Snail, będący inhibitorem ekspresji kadheryny E. Jego obecność, w połączeniu z wykrytym przeze mnie obniżeniem ilości kadheryny E między komórkami ICM oraz obecnością wimentyny w komórkach PE wskazywać może, że w komórkach tej linii może zachodzić proces przemiany nabłonkowo-mezenchymalna (EMT) lub proces do niej podobny.