Interspecific transfer of recognition cues and nestmate recognition in mixed colonies of the facultative social parasitic ant species Formica sanguinea

Niektóre gatunki owadów społecznych przebyły drogę ewolucyjną prowadzącą do pasożytniczego trybu życia, tj. do różnych form eksploatacji systemu społecznego gospodarza. Jedną z form pasożytnictwa społecznego mrówek jest tzw. niewolnictwo (dulozja), polegające na wykorzystywaniu pracy robotnic innych gatunków, porywanych z ich gniazd jako poczwarki podczas rajdów rabunkowych i zanoszonych do gniazda pasożyta, gdzie kończą swój rozwój. Owady społeczne do rozróżniania osobników swoich i obcych wykorzystują węglowodory oraz lipidy pokrywające powierzchnię ich ciała. Każdą kolonię charakteryzuje swoista dla niej mieszanina związków, stanowiąca identyfikator zapachowy, który zapamiętywany jest przez członków kolonii w okresie kilku dni od wyklucia z poczwarki. Cecha ta wykorzystywana jest przez mrówki uprawiające niewolnictwo: osobniki wylęgłe ze zrabowanych poczwarek w obcej kolonii integrują się z jej członkami i uzupełniają jej siłę roboczą. Niewolnictwo u mrówek może mieć charakter fakultatywny lub obligatoryjny. W pierwszym przypadku kolonie gatunku pasożytniczego zdolne są do przetrwania bez niewolnic, gdyż ich robotnice mają zdolność do wykonywania wszystkich czynności niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania kolonii. Z kolei robotnice gatunków obligatoryjnie uprawiających pasożytnictwo są tak dalece wyspecjalizowane w napadaniu na kolonie gospodarza i porywaniu z nich poczwarek, że zatraciły zdolność do wykonywania innych funkcji na rzecz kolonii. Tym samym gatunki te reprezentują wyższy poziom w ewolucji niewolnictwa. Pasożyty społeczne wykorzystują różne strategie chemiczne do tego, aby przełamać barierę kolonii gospodarza w postaci systemu rozpoznawania swoich i obcych. W przypadku gatunków obligatoryjnie uprawiających niewolnictwo zaobserwowano zjawisko mimikry chemicznej, co oznacza, że mrówki gatunku pasożytniczego są podobne do osobników gatunku niewolniczego pod względem identyfikatora zapachowego. Jednakże dokładna rola tej cechy oraz jej wartość przystosowawcza nie zostały dostatecznie wyjaśnione. Zagadnienie to wymaga zatem dalszych badań, a szczególnie dobrym ich obiektem wydają się być gatunki fakultatywnie uprawiające niewolnictwo, które jak dotychczas są dość słabo poznane pod względem ekologii chemicznej. Badania prowadzone przez Czechowskiego (1994) sugerowały, że mrówki Formica sanguinea przejmują identyfikator zapachowy od swoich niewolnic, przynajmniej wtedy, gdy rolę tę pełnią robotnice gatunków z grupy Formica rufa, co w naturze zdarza się bardzo rzadko. W celu zbadania, czy między mrówkami F. sanguinea oraz ich nietypowymi niewolnicami istotnie dochodzi do wymiany zapachów identyfikacyjnych, utworzono w warunkach laboratoryjnych kolonię mieszaną z udziałem mrówek F. polyctena oraz cztery kolonie jednogatunkowe (po dwie na gatunek). Za pomocą testów behawioralnych mierzono agresję mrówek z kolonii jednogatunkowych w stosunku do mrówek z innych kolonii jednogatunkowych lub z kolonii mieszanej (Publikacja 1.). Badania te miały na celu ustalenie, czy w przypadku mrówek z kolonii mieszanych kontakt z osobnikami innego gatunku wpływa na ich zapach identyfikacyjny, a przez to na akceptację przez mrówki własnego gatunku. Doświadczenie to wykazało, że koegzystencja z F. sanguinea miała wyraźny wpływ na mrówki F. polyctena, które były o wiele częściej odrzucane przez mrówki własnego gatunku niż mrówki z kolonii jednogatunkowej. Co więcej, mrówki z kolonii jednogatunkowych wyraźnie odróżniały osobniki własnego i obcego gatunku z kolonii mieszanych, traktując te ostatnie z większą agresją. Aby sprawdzić, czy podwyższona agresja wobec mrówek z kolonii mieszanych związana jest z ich identyfikatorem chemicznym, utworzona została kolonia złożona z mrówek F. sanguinea i F. rufa oraz kolonie jednogatunkowe. Procedura testów behawioralnych była podobna jak w poprzednim doświadczeniu, jednak tym razem wykonano również analizę chemiczną węglowodorów wypłukanych z powierzchni ciała mrówek (Publikacja 2.). Badania te wykazały, że mrówki różnych gatunków z kolonii mieszanej przekazały sobie wzajemnie substancje zapachowe. Fakt pozyskania węglowodorów od obcego gatunku przez mrówki z kolonii mieszanej skorelowany był z podwyższoną agresją wobec nich. Co więcej, wyniki analiz chemicznych oraz testów behawioralnych wykazały, że różnica między zapachami identyfikacyjnymi obu gatunków w obrębie kolonii mieszanej nie została zredukowana do poziomu, który byłby niewyczuwalny dla mrówek. Oznacza to, że współbytowanie w obrębie kolonii mieszanej zmniejszyło, lecz nie wyeliminowało różnic zapachowych między mrówkami F. sanguinea i F. rufa. W warunkach naturalnych gatunkiem, który najczęściej pada ofiarą niewolnictwa ze strony mrówek F. sanguinea, jest F. fusca. Aby sprawdzić, czy w koloniach F. sanguinea z niewolnicami tego gatunku występują różnice międzygatunkowe pod względem identyfikatora zapachowego, pobrano z terenu osobniki gatunku pasożytniczego oraz ich niewolnice z 11 kolonii, jak również mrówki gatunku gospodarza z 21 kolonii wolno żyjących. Wyniki analiz chemicznych potwierdziły istnienie różnic w profilu węglowodorowym między osobnikami obu gatunków (Publikacja 4.). Ponadto funkcjonowanie w kolonii F. sanguinea miało wyraźny wpływ na identyfikator zapachowy mrówek F. fusca – ich profil węglowodorowy został wzbogacony o związki charakterystyczne dla gatunku pasożytniczego. Tym niemniej, oba gatunki w kolonii mieszanej zachowały pewną odrębność pod względem zapachu identyfikacyjnego. Wnioski płynące z analiz chemicznych były zgodne z wynikami testów behawioralnych (Publikacja 3.). Ustalono, że mrówki F. sanguinea oraz ich niewolnice reagują agresywnie na osobniki F. fusca, które zostały wcześniej wyodrębnione z tej samej kolonii i hodowane w grupach jednogatunkowych. Podobny poziom agresji zarejestrowano względem mrówek F. fusca z kolonii wolno żyjących. Efektu takiego nie stwierdzono w stosunku do wyodrębnionych grup mrówek F. fusca, które były hodowane razem z osobnikami F. sanguinea (wariant kontrolny). Wynik ten pokazuje, że mrówki F. sanguinea wpływają na zapach identyfikacyjny swoich niewolnic w stopniu, który ma znaczenie dla rozpoznawania swoich i obcych w obrębie kolonii. W przypadku mrówek F. sanguinea separacja i przetrzymywanie w grupach jednogatunkowych (bez niewolnic F. fusca) nie miały wpływu na ich akceptowanie przez mrówki z kolonii źródłowej. Oznacza to, że zwrotny wpływ niewolnic na zapach identyfikacyjny mrówek F. sanguinea był stosunkowo niewielki. Ponadto testy behawioralne ujawniły, że niewolnice F. fusca wykazują niewielką zdolność do rozpoznawania mrówek z obcych kolonii F. sanguinea, tj. zachowują się wobec nich tolerancyjnie. Efekt ten można wytłumaczyć dużą różnorodnością zapachów identyfikacyjnych w obrębie kolonii mieszanej, wynikającą nie tylko z różnic międzygatunkowych, ale także z faktu, że niewolnice pochodzą z różnych, najpewniej niespokrewnionych kolonii. To z kolei przekłada się na różnice w składowej genetycznej profilu węglowodorowego osobników. Różnice te prawdopodobnie uniemożliwiają niewolnicom skuteczne uczenie się polegające na wytworzeniu dokładnego odwzorowania zapachu kolonii w układzie nerwowym. Mrówki F. sanguinea, w przeciwieństwie do swoich niewolnic, wykazywały agresję w stosunku do osobników własnego gatunku z obcych kolonii. Jednocześnie przejawiały niski poziom agresji lub zgoła tolerowały obce (cudze) niewolnice. Wynik ten może być interpretowany w charakterze przystosowania ewolucyjnego do zmienności zapachu identyfikacyjnego w obrębie kolonii mieszanej: mrówki F. sanguinea unikają agresji wobec osobników, których zapach wskazuje na to, że są niewolnicami, nawet jeśli różni się on od zapachu współtowarzyszek z gniazda, z którymi dotychczas miały kontakt. W przeciwnym razie nowe niewolnice, które z racji braku pokrewieństwa dotychczasowymi niewolnicami mogą mieć odmienny zapach (biorąc pod uwagę, że jest on przynajmniej częściowo determinowany genetycznie), byłyby atakowane przez mrówki F. sanguinea. Interpretacja ta pociąga za sobą domniemanie istnienia zapisanego w układzie nerwowym i kształtowanego genetycznie wzorca fenotypu zapachowego niewolnic biorącego udział w ich rozpoznawaniu. Różnice w profilu węglowodorowym między mrówkami F. fusca z kolonii wolno żyjących i niewolnic tego gatunku z kolonii F. sanguinea – potwierdzone wynikami testów behawioralnych – pokazują, że F. sanguinea stosuje wobec swych niewolnic strategię dominacji chemicznej. Różni to F. sanguinea od pasożytów społecznych uprawiających niewolnictwo obligatoryjne, w których przypadku stwierdzono stosowanie mimikry chemicznej względem gatunku gospodarza. Biorąc pod uwagę, że w koloniach F. sanguinea niewolnice stanowią mniejszość (w odróżnieniu od pasożytów obligatoryjnych), strategia dominacji (manipulacji) chemicznej może być łatwo stosowana poprzez wymianę węglowodorów pomiędzy osobnikami w trakcie interakcji społecznych. Na pośrednim etapie ewolucji niewolnictwa, reprezentowanym przez F. sanguinea, wystarczającym lub nawet bardziej korzystnym sposobem na zmniejszenie różnic zapachowych między gatunkami w obrębie kolonii mieszanej jest przekazywanie niewolnicom własnych substancji rozpoznawczych. Wyniki zaprezentowanych w rozprawie badań pokazują, że mrówki F. sanguinea zdolne są do współżycia z osobnikami innego gatunku w obrębie kolonii mieszanej, nawet jeśli między obu gatunkami występują różnice zapachowe. Ponadto, wyniki testów behawioralnych wskazują, że różnice te mają potencjalne znaczenie dla rozpoznawania swoich i obcych, tj. przekładają się na zaobserwowane różnice w poziomie agresji między kombinacjami doświadczalnymi. Oznacza to, że pełna zgodność zapachowa nie jest warunkiem koniecznym współżycia w ramach jednej kolonii mrówek uprawiających niewolnictwo oraz niewolnic. Jednakże, biorąc pod uwagę powszechność zjawiska mimikry chemicznej u mrówek obligatoryjnie uprawiających niewolnictwo, można sądzić, że podobieństwo zapachowe do osobników gatunku niewolniczego przynosi pasożytowi społecznemu korzyści poprzez zwiększoną efektywność wypraw rabunkowych i/lub zmniejszone ryzyko tzw. rebelii lub sabotażu ze strony niewolnic.

Some social insect species have passed evolutionary route leading to the parasitic mode of life in which host colony's social system might be exploited in many different ways. One of the forms of social parasitism is so- called slavery (dulosis) defined as an exploitation of the labor performed by workers belonging to other species which are removed as pupae form their natal nests during slave raids and taken to the parasite's colony where they are allowed to complete their development. Social insects use hydrocarbons and lipids spread over their body surface to distinguish between nestmates and intruders. Each colony is unique in the possession of its own mixture of compounds, which constitute its recognition signature learned by colony members during early adulthood. The capacity of ants to learn colony's odor during a short period after eclosion is exploited by slave-making ants: individuals which emerge from stolen pupae integrate into the alien society and replenish its workforce. Slave-making ant species are either facultative or obligate social parasites at the stage of mature colony. The former can survive without slaves since their workers are able to fulfill all domestic duties. In contrast, workers of obligate slave-making species are specialized on raiding host colonies and stealing pupae to the degree which makes them unable to perform other tasks required for the normal colony functioning. Thus, these species represent more advanced (ultimate) stage in the evolution of slavery. Social parasites use various chemical strategies to pass through the recognition barrier of host species. In obligate slave-making species a chemical mimicry has been evidenced which means that their recognition signature closely resembles that of the host species. However, the exact role and adaptive value of this strategy remain unclear. More light on this issue can be shed by studies on facultative slave-making species, which so far have been studied poorly in respect of their chemical ecology. Results of the experiments conducted by Czechowski (1994) suggested that
F. sanguinea ants acquire recognition cues from their slaves, at least form atypical ones belonging to the F. rufa species group, which are hardly ever enslaved in natural conditions. To show whether there is an interspecific exchange of recognition cues between F. sanguinea and their atypical slaves, I formed a mixed colony containing F. polyctena workers, and four homospecific (pure) ones (two per species). Using behavioral bioassays I assessed the level of aggression of ants from homospecific colony toward ants from other homospecific colony or a mixed one (Publication #1). In this way I intended to reveal the hypothesized effect of heterospecific individuals on the odor and acceptance of the focal ants from mixed colony. I found that living in a mixed colony has a clear effect on F. polyctena ants, which were rejected by conspecific ants more often relative to ants from homospecific colony. What is more, ants from homospecific colonies clearly distinguished between ants of both species that formed the mixed colony, heterospecific individuals being treated with a higher aggression.
To examine whether elevated aggression toward ants from a mixed colony is reflected by the differences in chemical recognition label, I used a mixed colony composed of F. sanguinea and F. rufa ants, along with homospecific ones. The protocol of behavioral studies was similar as previously, and was complemented with the chemical analyses of hydrocarbons extracted from ants' cuticle (Publication #2). This study revealed that ants of both species exchanged chemical recognition cues. The acquisition of recognition cues from ants belonging to the different species was associated with the ants from the mixed colony being treated with a higher degree of aggression. Moreover, the chemical data coupled with the results of behavioral analyses evidenced that the exchange of recognition cues was insufficient to reduce species-related differences between recognition labels to the level, at which they would be not detectable by ants. Thus, living in a mixed colony reduced, but not eliminated, odor differences between the species. In the wild, they are F. fusca ants which are enslaved by F. sanguinea most frequently. To examine whether there are species-specific differences in recognition signatures when
F. fusca plays a role of slaves, I sampled 11 field F. sanguinea colonies for parasitic ants and their slaves, as well as 21 free-living host colonies. Results of the chemical analyses have confirmed differences in the profile of cuticular hydrocarbons between both species (Publication #4). Moreover, enslavement had a clear effect on the F. fusca recognition signature which became enriched in compounds characteristic of the slave-maker species. Nevertheless, F. fusca slaves can still be differentiated from F. sanguinea based on the cuticular hydrocarbon profile showing that some interspecific differences in recognition signatures were still present in the mixed colonies.
The conclusions based on the results of chemical studies on the F. sanguinea colonies containing F. fusca slaves were consistent with the outcome of behavioral bioassays (Publication #3). I found that F. sanguinea ants and their slaves behave in an aggressive way toward
F. fusca ex-nestmates, which have been separated and reared in pure (homospecific) groups. The level of aggression was similar to that observed in tests in which F. fusca ants from the free-living colonies were presented. In contrast, no aggression was observed toward F. fusca slaves which were allowed to still have a contact with F. sanguinea (control group). This result shows that F. sanguinea ants affect slave's recognition signature to the degree which is relevant for nestmate recognition. In contrast, species-separation has no effect on the acceptance of F. sanguinea . Thus, the reciprocal effect of slaves on the recognition signature of slave-making ants has proved to be relatively small. In addition, aggression test revealed that F. fusca slaves perform poorly in discriminating against ants from alien F. sanguinea colonies. This effect can be attributed to a genetically based diversity of recognition cues present in mixed-species colonies and resulting from interspecific differences in the pattern of cuticular hydrocarbon production, and from slaves originating from many unrelated colonies. Such a diversity seemingly hampers accurate colony odor learning in slaves. Formica sanguinea ants, as opposed to their slaves, exhibited hostility toward slave-making ants from alien colonies. No such an effect was observed in response to alien slaves. In other words, slave-making ants behaved in an aggressive manner toward alien conspecifics while being still tolerant toward alien slaves. This outcome can be interpreted in terms of evolutionary adaptation to recognition cue diversity in a mixed colony: F. sanguinea avoid aggression toward any individual which is likely to be a slave, even if its CHC profile deviate from that characteristic for nestmate slaves. Otherwise, new slaves possessing recognition signature reflecting recognition alleles which have not been represented in parasite's colony yet, would be attacked by F. sanguinea ants. Such an interpretation implies the existence of genetically controlled template in neural system of F. sanguinea ants, which is used for slave recognition.
The pattern of chemical differences between free-living host ants and enslaved ones, confirmed by the results of aggression tests, shows that F. sanguinea ants employ a strategy of chemical dominance. This is in contrast to the obligate slave-making ants which have been evidenced to to mimic the odor of host species. However, taking into consideration that in colonies of F. sanguinea ants slaves as a rule constitute a minority of society members (in contrast to obligate slave-makers), the strategy of chemical dominance (manipulation) might well be executed via inter-individual exchange of cuticular hydrocarbons during social interactions. Thus, at the intermediate stage of the evolution of slavery represented by F. sanguinea ants, it is sufficient, or perhaps even more beneficial for them, to reduce heterospecific odor differences within colony by the transfer of own recognition cues to slaves. Results of my studies show that F. sanguinea ants are able to coexist with heterospecific ants within a mixed colony even though there are still differences in recognition signatures between the species. Moreover, results of behavioral tests demonstrate that these differences are potentially relevant for the nestmate recognition, i.e. they translate into differences in the observed pattern of aggressive behaviors among experimental treatments. Thus, it can be concluded that a perfect odor congruence between slave-making ants and their slaves is not necessary for their co-existence as members of the same colony. However, given a wide-spread chemical mimicry exhibited by obligate slave-making ants, it can be hypothesized that being chemically similar to slaves is beneficial for social parasites possibly through the effect on the efficiency of slave raids, and/or by reduction of the risk of so-called slave rebellion or sabotage.