Peptide hydrogels functionalized with SDF-1 as a tool to improve myogenesis in vitro and skeletal muscle regeneration in vivo

Zdolność organizmu do samodzielnego poruszania się i reagowania na bodźce środowiskowe jest w dużej mierze zależna od prawidłowego funkcjonowania mięśni szkieletowych, stanowiących aktywną podjednostkę układu ruchu. Rozległe urazy, zmiany spowodowane wiekiem lub rozwój chorób degeneracyjnych (np. dystrofii mięśniowej Duchenne’a, DMD), mogą niejednokrotnie zaburzać prawidłowe funkcjonowanie mięśni szkieletowych, tym samym limitując sprawność ruchową organizmu i prowadząc do utraty samodzielności. Mięśnie szkieletowe dysponują unikatowym mechanizmem regeneracyjnym, za który odpowiedzialna jest populacja mięśniowo specyficznych, unipotencjalnych komórek macierzystych – komórek satelitowych. Zlokalizowane pomiędzy błoną podstawną a sarkolemmą włókna mięśniowego, pozostają uśpione w stanie równowagi fizjologicznej, jednak w odpowiedzi na impuls indukowany uszkodzeniem aktywują się i zaczynają intensywnie dzielić, różnicować i fuzjować, tworząc wielojądrowe miotuby. Rezerwuar komórek satelitowych może być jednak istotnie zmniejszony wraz z wiekiem bądź w wyniku rozwoju chorób czy urazów, tym samym wspomniany endogenny mechanizm regeneracji może być zaburzony i niewystarczający dla odtworzenia funkcjonalnej tkanki. Wskazane ograniczenia doprowadziły do intensywnych badań ukierunkowanych na poszukiwaniu strategii wpierających regenerację mięśni szkieletowych oraz przywrócenie ich pełnej funkcjonalności. Jednym z podejść mających na celu usprawnienie regeneracji mięśni jest połączenie terapii komórkowych z wykorzystaniem biomateriałów. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) charakteryzują się szczególnym potencjałem terapeutycznym, ze względu na możliwość ich różnicowania w wyspecjalizowane typy komórek oraz możliwość otrzymywania z komórek pacjenta, tym samym zapewniając całkowitą zgodność między przeszczepem a biorcą. Wykorzystanie iPSC w terapii nie jest jednak pozbawione ograniczeń, związanych przede wszystkim z ich efektywnym dostarczaniem komórek do organizmu. Poszukuje się zatem metod usprawniających tę procedurę, między innymi wykorzystując biomateriały jako nośniki komórek. W szczególności hydrożele stanowią obiecujący wybór, ze względu na biokompatybilność i potwierdzoną skuteczność jako opatrunki lub wypełniacze tkankowe, a także ich unikalne właściwości fizykochemiczne. Struktura chemiczna hydrożeli pozwala ponadto na ich funkcjonalizację, czyli wzbogacanie cząsteczkami aktywnymi biologicznie, co może dodatkowo wspierać regenerację tkanek. W niniejszej pracy wykorzystano hydrożele peptydowe funkcjonalizowane peptydami mimikującymi SDF-1 (SDF-1-X i SDF-1-Y), jako materiał wspierający miogenezę in vitro oraz in vivo. W pierwszym etapie badań skupiono się na ocenie wpływu zaprojektowanych peptydów na ludzkie komórki zaangażowane w regenerację mięśni szkieletowych, tj. mioblasty i fibroblasty, oraz ludzkie komórki o potencjale terapeutycznym, tj. mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego oraz indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Następnie oceniono wpływ hydrożeli funkcjonalizowanych badanymi peptydami na populacje ludzkich mioblastów i fibroblastów oraz komórek śródbłonka naczyń i mioblastów otrzymywanych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Oceniono wpływ funkcjonalizowanych hydrożeli peptydowych na funkcje komórek, obejmujące ocenę proliferacji, apoptozy, migracji czy różnicowania i wytypowano hydrożel R1-SDF-1-X, jako obiecujący w zastosowaniach terapeutycznych. Aby ocenić wpływ wybranego hydrożelu na regenerację mięśni szkieletowych in vivo wykorzystano dwa modele uszkodzenia mięśni: ostre uszkodzenie mięśnia szkieletowego indukowane podaniem chlorku baru (myszy SCID) oraz przewlekłe uszkodzenie spowodowane zmianami chorobowymi w mysim modelu DMD (myszy SCID mdx). Ocena regeneracji mięśni po przeszczepieniu hydrożelu lub hydrożelu i mioblastów otrzymanych z ludzkich iPSC, została przeprowadzona na poziomie funkcjonalnym, strukturalnym i molekularnym. Wykazano stymulujący wpływ hydrożelu R1 SDF-1-X na regenerację mięśni w obu modelach, tym samym sugerując, że może być on rozważany jako biomateriał w leczeniu urazów mięśni szkieletowych.

Independent locomotive capacity and ability to react to external stimuli, depends greatly on proper skeletal muscle function, i.e. active subunit of musculoskeletal system. Extensive injuries, age-related structural changes or development of neurodegenerative diseases (e.g. Duchenne’s muscular dystrophy) often impede skeletal muscle function, thereby limiting locomotor function and causing loss of autonomy. Skeletal muscles are characterized by unique ability to regenerate, orchestrated by skeletal muscle-specific, unipotent stem cell population – satellite cells. These cells reside between sarcolemma and basement membrane and under physiological conditions remain quiescent. In response to stimuli induced through muscle damage, these cells are activated and start to proliferate, differentiate, and fuse forming multinucleated myotubes. Satellite cell reservoir can be significantly reduced with age, as a result of a disease development or injury, thereby the abovementioned endogenous regenerative mechanism might be disturbed and not sufficient to restore functional tissue. These limitations initiated extensive research aimed at seeking strategies supporting skeletal muscle regeneration and restoration of their complete function. One of the approaches aimed at improving skeletal muscle regeneration is combining cell therapy with the use of biomaterials. Particularly, induced pluripotent stem cells are characterized by therapeutic potential, due to their ability to differentiate in different specialized cell types and the possibility to generate them from patients’ cells, thus securing complete compatibility between the transplant and the recipient. Therapeutic use iPSC is however constrained by inherent limitations related to an effective way of cell administration into the tissue. Methods aimed at improving this process are being investigated, among them the use of biomaterials as cell carriers. Particularly hydrogels are considered promising, due to their biocompatibility and confirmed therapeutic application as wound dressings or tissue fillers, and their unique physicochemical properties. Furthermore, hydrogel’s structure allows their functionalization, i.e. enrichment with biologically active particles, which can further support tissue regeneration. In this thesis peptide hydrogels functionalized with SDF-1 mimicking peptides (SDF 1-X and SDF-1-Y) were investigated as a tool to improve myogenesis in vitro and in vivo. Initially, the activity of the designed peptides was evaluated and their impact on human cells engaged in skeletal muscle regeneration, i.e., myoblasts and fibroblasts, as well as, on cells characterized by therapeutic potential, i.e., bone marrow mesenchymal stem cells and induced pluripotent stem cells, was assessed. Next, the impact of hydrogels functionalized with investigated peptides was evaluated on human cell populations: myoblasts, fibroblasts, and endothelial cells, as well as induced pluripotent stem cell-derived myoblasts. Hydrogel impact on cell functions, including proliferation, apoptosis, migration, or differentiation was assessed and R1-SDF-1-X was marked promising for therapeutic approaches. To assess whether the treatment with selected hydrogels influence skeletal muscle regeneration in vivo, two murine injury models were investigated: acute injury model, induced by barium chloride injection (SCID mice) and chronic injury model in murine DMD model (SCID mdx). The evaluation of the efficacy of skeletal muscle regeneration following hydrogel or hydrogel and induced pluripotent stem cell-derived myoblasts transplantation, was assessed on functional, structural and molecular levels. Stimulating effect of the transplant was observed in both models, suggesting that R1-SDF-1-X peptide hydrogel is a promising biomaterial considered for treating skeletal muscle injuries.