Globalna analiza ilościowa białek zaangażowanych w patogenezę proteinopatii TDP-43

Nadrzędnym celem badań opisanych w rozprawie doktorskiej było zbadanie jak zaburzona funkcja TDP-43 wpływa na charakterystykę proteomu komórki. Potencjalnie wykryte zmiany w poziomie białek pozwolą na określenie ścieżek biochemicznych, które mogą być zaangażowane w rozwój zmian chorobowych w proteinopatiach TDP-43. W tym celu przeprowadzono globalną analizę proteomiczną tkanek mózgów, pobranych post-mortem od pacjentów, u których zdiagnozowano choroby neurodegeneracyjne – stwardnienie zanikowe boczne i otępienie czołowo-skroniowe. Analiza proteomiczna wykorzystująca spektrometrię mas obejmuje przygotowanie próbki do pomiaru, rozdzielenie chromatograficzne mieszaniny otrzymanych peptydów, analizę rozdzielonych peptydów przy zastosowaniu wysokorozdzielczej spektrometrii mas oraz bioinformatyczną analizę otrzymanych danych. W ramach rozprawy doktorskiej przeprowadzono optymalizację procedury przygotowania próbki tkanki mózgowej do pomiaru oraz optymalizację parametrów samego pomiaru spektrometrem mas w celu otrzymania możliwie najlepszych wyników przeprowadzanych analiz proteomicznych. Analiza ilościowa w przypadku badań proteomicznych jest analizą różnicową – możliwe jest porównanie ilości danego białka w próbkach z grupy eksperymentalnej i grupy kontrolnej. W ramach rozprawy doktorskiej zastosowano analizę ilościową wykorzystująca znaczniki izobaryczne TMT (Tandem Mass Tag), które są jednym z rodzajów znaczników izotopowych. Każdy z izobarycznych znaczników TMT ma taka samą masę (stosunek m/z) na widmie pełnym MS. Podczas fragmentacji HCD następuję rozpad znaczników TMT co umożliwia rejestrację grup reporterowych na widmie MS2 lub MS3. Każda grupa reporterowa różni się stosunkiem m/z i jest charakterystyczna dla danego znacznika TMT – umożliwia to przeprowadzenie różnicowej analizy ilościowej na podstawie intensywności każdej z grup reporterowych, zarejestrowanych na widmie fragmentacyjnym. Wykorzystanie zoptymalizowanej procedury przygotowania próbki oraz znaczników izobarycznych TMT umożliwiło przeprowadzenie precyzyjnej i dokładnej różnicowej analizy ilościowej białek w próbkach tkanki mózgowej pacjentów, u których zdiagnozowano obecność proteinopatii białka TDP-43. Przeprowadzona analiza ilościowa pozwoliła naidentyfikację grup białek oraz ścieżek przekazywania sygnału, które są zmienione w przypadku badanych chorób neurozwyrodnieniowych – stwardnienia zanikowego bocznego oraz otępienia czołowo-skroniowego.