Effects of sex hormones on cell death in cells with mutations responsible for Leber’s hereditary optic neuropathy

Dziedziczna neuropatia nerwu wzrokowego Lebera (LHON) jest dziedziczoną odmatczynie formą obustronnej i bezbolesnej ślepoty spowodowanej izolowaną atrofią nerwu wzrokowego w wyniku mutacji punktowych w mitochondrialnym DNA (mtDNA). LHON występuje głównie u młodych mężczyzn, atakując oboje oczu jednocześnie lub kolejno w okresie kilku miesięcy lub tygodni, zazwyczaj z bardzo złym rokowaniem. Szacuje się, że 1 na 20 000 osób w Europie cierpi na tę chorobę. Najczęstsze trzy mutacje punktowe mtDNA stanowią ponad 90% zdiagnozowanych przypadków LHON: m.11778G> A, m.3460G> A i m.14484T> C. W większości przypadków mtDNA jest w 100% zmutowany w każdej komórce, ale tylko komórki zwojowe siatkówki (ang. retinal ganglion cells – RGC) są dotknięte chorobą. Nie wiadomo, dlaczego tylko komórki zwojowe siatkówki są objęte procesem chorobowym i dlaczego mężczyźni są od czterech do pięciu razy bardziej narażeni na rozwój LHON. Mitochondria są głównym źródłem reaktywnych form tlenu (ROS) w komórce, a zmiany w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym lub wytwarzaniu ROS mogą prowadzić do indukcji apoptozy. Uważa się, że u kobiet estrogeny modyfikują stopień dysfunkcji mitochondriów, w tym zaburzoną syntezę ATP, stres oksydacyjny i apoptozę. Ponadto doniesiono, że wysokie stężenia testosteronu inicjują szlak apoptotyczny i indukują neurotoksyczność w komórkach linii nerwiaka zarodkowego. Celem tego projektu było określenie wpływu testosteronu na fizjologię komórek z mutacją LHON i komórek kontrolnych bez mutacji i określenie możliwych różnic między płciami w mechanizmach śmierci komórek. Materiał, którego dotyczy problem, był niedostępny do badania, dlatego w celu naśladowania procesów zachodzących w komórce wykorzystano model komórkowy unieśmiertelnionych limfocytów B - limfoblastów. Metodologia pracy doktorskiej polegała na badaniu różnic w fizjologii komórek przy użyciu wspomnianego powyżej modelu komórek pacjentów i komórek kontrolnych traktowanych różnymi stężeniami testosteronu. Wpływ testosteronu na różne mechanizmy śmierci komórek w LHON apoptozę i autofagię / mitofagię nigdy wcześniej nie był analizowany. Autofagia służy jako mechanizm usuwania i recyklingu wszystkich uszkodzonych organelli komórkowych. W przedstawionej pracy stwierdzono, że komórki z mutacją m.11778G> A są znacznie bardziej podatne na tworzenie nukleosomów i aktywację kaspaz efektorowych, które cechują apoptotyczną śmierć komórki. Analiza fizjologii mitochondriów wykazała, że ogólnie komórki LHON mają wyższą wydolność oddechową w porównaniu do kontroli, co wskazuje na podwyższony poziom stresu w zmutowanych komórkach. Po drugie, oceniono potencjał błony mitochondrialnej, jednak nie zaobserwowano statystycznie istotnej różnicy w analizowanych liniach komórkowych. Zaobserwowano jednak, że w żeńskich komórkach zdrowych nosicieli mutacji LHON, MMP maleje wraz ze wzrostem stężenia testosteronu. Ponadto poziom białka Nrf-1 (jądrowy czynnik oddechowy 1) wzrastał w komórkach LHON w obecności testosteronu, co sugeruje, że komórki próbują kompensować niedobór kompleksu I. Ponadto z wykorzystaniem metody Western blot zaobserwowano prawie dwukrotny wzrost białka związanego z androgenem 24, a zaobserwowana różnica może wskazywać, że komórki z mutacją m.11778G>A od chorych mężczyzn mogą być bardziej wrażliwe na testosteron. Stwierdzono, że komórki z mutacją wykazują wyższą ekspresję receptorów mitofagii BNIP3 i BNIPL/Nix w pożywce z testosteronem i mają większą masę mitochondrialną, co można wyjaśnić zmniejszoną maszynerią przeżycia komórek spowodowaną przez mutacje w mtDNA, co zostało potwierdzone przez zaobserwowany wzrost apoptotycznej śmierci komórek. Zaobserwowany niższy poziom autofagii w zmutowanych komórkach korelował ze zwiększonym poziomem białek BNIP3 i BNIP3L/Nix. Wyniki tego projektu mogą przyczynić się do zwiększenia aktualnej wiedzy na temat patogenezy LHON i możliwych czynników ryzyka predysponujących do tej choroby.

Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is a maternally inherited form of incurable bilateral and painless vision loss due to isolated atrophy of the optic nerve caused by point mutations in mitochondrial DNA (mtDNA). LHON occurs mostly in young men affecting both eyes simultaneously or sequentially in a period of a few months or weeks with usually very poor visual prognosis. It is estimated that 1 in 20,000 individuals in Europe are affected with this disease. The most common three mtDNA point mutations account for over 90% of diagnosed LHON cases: m.11778G>A, m.3460G>A and m.14484T>C. In most cases, mtDNA is 100% mutated in every cell, but only retinal ganglion cells (RGC) are affected. It is not known why only RGCs are affected and why men are four to five times more likely to develop LHON. Mitochondria are the main source of reactive oxygen species (ROS) in the cell and changes in mitochondrial respiratory chain or ROS production can lead to induction of apoptosis. In females, estrogens are thought to modify the severity of mitochondrial dysfunction, including defective ATP synthesis, oxidative stress, and apoptosis. Moreover, it has been reported that high concentrations of testosterone initiate an apoptotic pathway and induce neurotoxicity in neuroblastoma cells. The aim of this project was to determine the impact of testosterone on cell physiology in the cells with LHON mutation and control cells with no mutation and determine possible gender differences in cell death mechanisms. Affected material was unavailable for study, therefore to mimic the processes happening in the cell a model of immortalized lymphocytes - lymphoblasts was used. PhD thesis methodology relied on studying differences in cell physiology using the above-mentioned cell model of patient and control cells after treatment with different concentrations of testosterone. Induction of autophagy/mitophagy may be another component of sex-specific compensatory mechanisms to prevent accumulation of oxidatively damaged cellular components, protecting against mitochondrial dysfunction. In the presented thesis cells with the m.11778G>A mutation were found to be significantly more susceptible to nucleosome formation and effector caspase activation which serve as hallmarks of apoptotic cell death. Analysis of mitochondrial physiology showed that overall, LHON cells have a higher respiration capacity compared to controls which indicates that these cells are in more stressing conditions. Secondly, mitochondrial membrane potential was assessed, however, no statistically significant difference was observed in the analyzed cell lines. However, in unaffected female LHON mutations carriers MMP was found to decrease with an increase in testosterone concentration. In addition, Nrf-1 protein (nuclear respiratory factor 1) was increased in LHON cells after treatment with testosterone, this suggests that cells are trying to compensate for the Complex I deficiency, and testosterone within the physiological range can stimulate Nrf-1 expression. Also, an almost two-fold increase of androgen associated protein 24 was observed on western blots, the observed difference might indicate that cells with m.11778G>A mutation from affected men could be more sensitive to testosterone. Cells with the mutation were found to express higher levels of mitophagic receptors BNIP3 and BNIP3L/Nix in medium with testosterone and had greater mitochondrial mass, which can be explained by decreased cell survival machinery caused by mutations in the mtDNA, which was supported by the observed increase in apoptotic cell death. The observed impaired lower autophagic flux in mutant cells correlated with the increased levels of BNIP3 and BNIP3L/Nix in mutant cells as a result of an insufficient autophagic flux. The outcome of this project could contribute to current knowledge about the pathogenesis of LHON and possible risk factors predisposing to this disease.