Badanie własności fizycznych i modelowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w nano-skali z użyciem mikroskopii sił atomowych oraz analizy śledzenia nanocząstek

Celem pracy była analiza własności fizycznych pęcherzyków lipidowych w nanoskali. Aby to osiągnąć opracowano metodologię badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na mikroskopie sił atomowych (AFM) i porównano te wyniki z danymi otrzymanymi metodą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Badania tego rodzaju mogą być przydatne ze względu na zastosowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w procedurach diagnostycznych jak i do wykorzysta ich jako nośników leków.

Dane i metodologia. Badano pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z hodowanych w Zakładzie Fizyki Biomedycznej UW komórek nowotworu prostaty PC3 oraz odtworzone liofilizowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z tej samej linii komórkowej. Dodatkowo porównano wyniki ze sztucznie utworzonymi nanopęcherzykami — liposomami. Przeprowadzono eksperymenty z użyciem AFM oraz NTA oraz porównano wyniki eksperymentalne z modelowaniem komputerowym. Wykorzystano dwa modele komputerowe: Pierwszy z nich, stworzony wspólnie przez nasz zespół, służył do opisu kształtu i sztywności pęcherzyka osadzonego na powierzchni miki i bazował na teorii Canhama–Helfricha. Drugi opisywał osadzanie się pęcherzyków na podłożu, bazując na teorii ruchów Browna w kropli cieczy.

Wyniki. Opracowano procedurę obrazowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na AFM w cieczy, w szczególności efektywny sposób uzyskiwania pozbawionego zanieczyszczeń podłoża mikowego o dodatnim ładunku powierzchniowym. Badano również kąt przylegania pęcherzyków do podłoża i zaobserwowano jego malejącą zależność od średnicy pęcherzyka. Zapostulowano nową metodę badania błony lipidowej w oparciu o parametry geometryczne nanopęcherzyków, z wykorzystaniem modelowania. Zaobserwowano wzrost średnich średnic pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w czasie od nałożenia próbki na podłoże. Porównanie wielkości pęcherzyków uzyskanych różnymi metodami pokazało, że większe są średnice hydrodynamiczne (z NTA) niż geometryczne (z AFM).

Zasadnicze osiągnięcia i nowatorskie rezultaty uzyskane podczas pracy nad doktoratem obejmowały: ustalenie metodologii obrazowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na AFM, zaobserwowanie i zamodelowanie zwiększania się średnic geometrycznych wraz z czasem od nałożenia próbki na podłoże, zaproponowanie współczynnika skalowania AFM-NTA jako cechy charakteryzującej dany typ pęcherzyków, zauważenie i modelowe potwierdzone zależności zwiększania kąta przylegania i powiązanego z nim współczynnika wysokość / promień krzywizny (H/Rc) dla mniejszych pęcherzyków oraz zaproponowanie szybkiej procedury szacowania modułu zginania na podstawie geometrii pęcherzyków i ograniczonej liczby spektroskopii sił. Można liczyć, że praca przyczyni się zarówno do wzbogacenia metodologii badań nanopęcherzyków za pomocą AFM i NTA, jak i posłuży lepszemu poznaniu własności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

The aim of this work was to analyze the physical properties of lipid vesicles at the nanoscale. To achieve this, a methodology was developed to study extracellular vesicles using atomic force microscopy (AFM) and to compare these results with data obtained by nanoparticle tracking analysis (NTA). This type of research may be useful for the application of extracellular vesicles in diagnostic procedures and for their use as drug carriers.

Data and Methodology. Extracellular vesicles from PC3 prostate cancer cells cultured at the Department of Biomedical Physics, University of Warsaw, were studied, as well as reconstituted, lyophilized extracellular vesicles from the same cell line. In addition, results were compared with those for artificially created nanovesicles — liposomes. Experiments were conducted using AFM and NTA, and the experimental results were compared with computational modeling. Two computational models were used: the first, developed by our team was used to describe the shape and stiffness of a vesicle attached to a mica surface and was based on Canham–Helfrich theory. The second described the settling of vesicles on a substrate, based on the theory of Brownian motion in a liquid droplet.

Results. A procedure for imaging extracellular vesicles by AFM in liquid was developed, including an effective method for obtaining a contaminant-free mica substrate with a positive surface charge. The vesicle-substrate contact angle was also studied and it was observed to decrease with increasing vesicle diameter. A new method for studying lipid membranes was proposed, based on the geometric parameters of nanovesicles and informed by computational modeling. An increase in the average diameter of extracellular vesicles was observed over time after the sample was deposited on the substrate. A comparison of vesicle sizes obtained by different methods showed that the hydrodynamic diameters (from NTA) were larger than the geometric diameters (from AFM).

The principal achievements and innovative results obtained during my doctoral work included: establishing a methodology for imaging extracellular vesicles with AFM, observing and modeling the increase in geometric diameters over time after sample deposition on the substrate, proposing an AFM–NTA scaling factor as a characteristic of a given vesicle type, observing and modeling the relationship between the increasing contact angle and the related height / radius of curvature (H/Rc) ratio for smaller vesicles, and proposing a rapid procedure for estimating the bending modulus based on vesicle geometry and a limited number of force spectroscopy measurements. It is hoped that this work will contribute to enriching the methodology for studying nanovesicles using AFM and NTA and to a better understanding of the properties of extracellular vesicles.