Synthesis of 9-substituted 1α,25-dihydroxyvitamin D3 analogs

1α,25-Dihydroksywitamina D3 [kalcytriol, 1α,25(OH)2D3], biologicznie aktywna, hormonalna forma witaminy D3, reguluje gospodarkę wapniowo-fosforanową organizmu, pełni istotną rolę w regulacji procesów różnicowania i namnażania komórek, ma również wpływ na procesy immunologiczne. Sugeruje to możliwość licznych zastosowań terapeutycznych tego związku m. in. w leczeniu chorób związanych z zaburzeniem homeostazy wapniowo-fosforanowej (krzywicy i osteoporozy), a także chorób, w których upośledzona jest równowaga pomiędzy proliferacją i różnicowaniem komórek, takich jak łuszczyca, nowotwory (białaczka, rak prostaty i piersi) oraz choroby typu autoagresji immunologicznej. Niestety, potencjalne możliwości zastosowania kalcytriolu w medycynie są ograniczone ze względu na silny efekt kalcemiczny, jaki wywołuje ten związek, podany w ilościach terapeutycznych. Z tego powodu od wielu lat podejmowane są próby otrzymania pochodnych hormonu, które jednocześnie zachowują selektywną aktywność biologiczną, nie powodując wzrostu stężenia wapnia w organizmie. Spośród ponad 3000 analogów kalcytriolu zsyntezowanych do tej pory, większość zawierała modyfikacje w obrębie łańcucha bocznego lub pierścienia A. Niewiele jest natomiast znanych pochodnych tej witaminy, w których zmianie ulegałby układ sprzężonych wiązań podwójnych bądź pierścienie CD. Stąd też swoją uwagę skupiłam na pochodnych kalcytriolu, zawierających w swych cząsteczkach ugrupowania niepolarne przyłączone do C-9. W literaturze bardzo niewiele było informacji na temat wpływu podstawnika w tej pozycji na biologiczną aktywność związków z grupy witamin D. Przypuszczałam jednak, że obecność niepolarnych podstawników w pozycji 9 szkieletu witaminowego mogłaby spowodować wzrost oddziaływań pomiędzy hydrofobowymi aminokwasami kieszeni wiążącej receptora witaminy D (VDR), a syntetycznym ligandem. W ramach pracy doktorskiej zaprojektowałam i zsyntezowałam serię analogów kalcytriolu i 19-norkalcytriolu, posiadających dodatkowe metylowe, metylenowe lub etylidenowe ugrupowania przy C-9. Były wśród nich związki, zawierające w swej cząsteczce układ trienowy „odwócony” w stosunku do naturalnego hormonu, a mianowicie 19-norwitaminy D z podstawnikami alkilidenowymi w pozycji 9. Kluczowym etapem syntez nowych witamin była konstrukcja naturalnego lub „odwróconego” układu trienowego, łączącego pierścienie A i C, na drodze termicznego [1,7]-sigmatropowego przeniesienia wodoru w ich prewitaminowych izomerach. Do syntezy odpowiednich prewitamin wykorzystałam cztery alternatywne metody łączenia fragmentów budulcowych zawierających steroidowe pierścienie A i CD: sprzęganie Sonogashiry, Stille i Suzuki oraz nową procedurę, opartą na stereoselektywnej dehydratacji trzeciorzędowego 8β-alkoholu za pomocą odczynnika Burgessa. Opracowana przeze mnie nowa metoda budowy szkieletu witamin D może być z powodzeniem zastosowana do syntezy innych analogów kalcytriolu, zawierających modyfikacje w obrębie pierścieni CD. 1α,25-Dihydroksy-9β-metylo-19-norwitamina D3, pierwszy znany analog kalcytriolu posiadający podstawnik w pozycji 9β, otrzymałam w wyniku uwodornienia 9-metyleno-19-norkalcytriolu, prowadzonego w obecności homogennego katalizatora Wilkinsona. Badania biologiczne otrzymanych przeze mnie pochodnych 1α,25-dihydroksywitaminy D3 wykazały, że wprowadzenie niepolarnej grupy w pozycję 9 zmniejsza na ogół wiązalność analogu z receptorem witaminy D, efekt ten jednak zależy od rodzaju i orientacji takiego podstawnika. Interesujacym analogiem wydaje się 9β-metylo-19-norkalcytriol, charakteryzujący się podobną wiązalność do VDR jak naturalny hormon, ale wykazujący znacznie mniejszą aktywność kalcemiczną. Uzupełnieniem prowadzonych przeze mnie badań nad 9-podstawionymi pochodnymi kalcytriolu były eksperymenty polegające na naświetlaniu promieniowaniem ultrafioletowym 1α,25-dihydroksy-9-metyleno-19-norwitaminy D3. Związek ten charakteryzował się obecnością w cząsteczce „odwróconego” (w stosunku do naturalnego hormonu) układu trienowego, którego reakcja fotochemiczna prowadziła do powstania pentacyklicznego produktu o charakterze „odwróconego” suprasterolu, nieopisanego dotąd w literaturze. Przedstawiona praca doktorska włącza się w nurt badań, których celem jest poszerzenie wiedzy na temat zależności pomiędzy strukturą witamin z grupy D i ich aktywnością biologiczną. Zrozumienie tych zależności ma kluczowe znaczenie w procesie projektowania nowych leków.

1α,25-Dihydroxyvitamin D3 [calcitriol, 1α,25-(OH)2D3], the most potent metabolite of vitamin D3, beyond its classical role in regulation of calcium–phosphorous homeostasis, exerts control over many biological processes such as, for example, induction of cell differentiation and inhibition of cell proliferation. These findings make calcitriol potentially useful in various biomedical applications, including treatment of metabolic bone diseases, psoriasis, some kinds of cancers and immune disorders. However, the clinical application of 1α,25-(OH)2D3 is limited by its calcemic side effects. In order to enhance selective biological actions and minimize calcemic activity, more than 3000 vitamin D analogs, modified in different parts of the molecule, have been synthesized and biologically tested in the recent years, but only few of them have found clinical applications. The A-ring and the side chain of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 have been the major targets of chemical modifications. Significantly smaller number of vitamin D analogs with an altered triene system or CD-ring fragment were synthesized to date. Among them, only very few were characterized by substitution at C-9. Therefore, continuing the structure−activity studies carried out in our laboratories, I designed novel C-9 substituted analogs of calcitriol and 19-norcalcitriol, possessing various non-polar groups at this position. Since little was known about the biological effect of modification at C-9 position in calcitriol, I decided to synthesize the series of functionalized compounds, including 9α-methyl calcitriol and the unknown analog possessing 9β-methyl substituent. The presence of non-polar groups incorporated at position C-9 could potentially enhance interactions of such compounds with hydrophobic residues in the ligand binding pocket of the vitamin D receptor (VDR). Introduction of 9-alkylidene (methylene and ethylidene) substituents to the 19-norcalcitriol skeleton also seemed to be an interesting endeavor, because it could lead to 1α,25-(OH)2D3 analogs with the ‘reversed’ triene system A key feature of the syntheses of new vitamins involved the generation of the natural and non-natural vitamin D triene moieties by thermal sigmatropic [1,7]-H shifts of their from previtamin D isomers. The required previtamin D compounds were synthesized through four alternative approaches: Sonogashira, Stille, Suzuki coupling and stereoselective dehydration of a propargylic 8β-alcohol. The synthetic strategy, involving dehydration with Burgess reagent, which I developed, could be applied for preparation of other vitamin D compounds modified at the upper CD-fragment. 1α,25-Dihydroxy-9β-methyl-19-norvitamin D3, the first known calcitriol analog possessing 9β-substituent, was obtained by homogeneous hydrogenation of 9-methylene-19-norcalcitriol, performed in the presence of Wilkinson catalyst. The newly obtained analogs were biologically tested and it was found that their binding affinity for VDR as well as cell-differentiation activity strongly depends on the nature and orientation of the substituent attached to C-9. Thus, the analog bearing methyl group at 9β-position showed activity similar to the natural hormone, whereas all other modifications of calcitriol molecule resulted in decrease in biological activity of the synthesized analogs. As an extension of the studies on 9-substituted vitamin D3 compounds, I performed photochemical isomerization of 9-methylene-19-norcalcitriol characterized by the presence of the ‘reversed’ triene system in comparison to the natural hormone. The UV-induced process led to a single photoproduct of the ‘inverted’ suprasterol structure, that has not been described in the literature. The presented studies on 9-substituted calcitriol derivatives have broadened the knowledge on the relationship between the structure of vitamin D compounds and their biological activities.