Potential diagnostics antigens for trichinellosis - comparative analysis of Trichinella spiralis and Trichinella britovi antigens using immunoproteomics

Włośnica jest odzwierzęcą chorobą powodowaną przez nicienie z rodzaju Trichinella spp. W cyklu życiowym pasożyta wyróżniamy trzy stadia rozwojowe: formy dorosłe (Ad), larwy nowo narodzone (NBL) oraz inwazyjną larwę mięśniową (ML1). Obecnie sklasyfikowanych zostało dziesięć gatunków oraz trzy genotypy Trichinella. W Europie, oraz w Polsce dwa najpowszechniejsze gatunki to T. spiralis oraz T. britovi. Głównym źródłem zarażeń jest surowe, bądź niedogotowane mięso zawierające żywe larwy ML1 Trichinella spp. Z epidemiologicznego punktu widzenia największe znaczenie ma występowanie nicienia u zwierząt stanowiących źródło pożywienia dla ludzi - świń i dzików. Przyczyną większości przypadków zarażeń u ludzi jest T. spiralis, gatunek kosmopolityczny charakteryzujący się najwyższym stopniem inwazyjności. Jednakże coraz częściej notowane są przypadki zarażeń ludzi mniej inwazyjnym gatunkiem T. britovi w wyniku konsumpcji mięsa dzika. Komercyjne testy ELISA stosowane w serodiagnostyce włośnicy wykorzystują wydzielane przez komórki gruczołowe pasożyta (stichocyty) produkty ekskrecyjno-sekrecyjne (ES) larw ML1 T. spiralis. Testy obarczone są błędami wynikającymi z faktu stosowania jako antygenu wyłącznie produktów ES ostatniego stadium rozwojowego (ML1) T. spiralis, które utrudniają diagnozę wczesnego etapu inwazji pasożyta. Wskazuje to na niską czułość i specyficzność dostępnych testów. Poszczególne stadia rozwojowe Trichinella charakteryzują się odmiennym profilem białkowym ze względu na zachodzące procesy dojrzewania pasożyta i jego migrację między narządami w organizmie żywiciela. Dlatego kluczowe znaczenie w rozwoju diagnostyki zarażenia ma poznanie proteomów antygenów somatycznych nicienia, jak również produktów ES początkowych stadiów rozwojowych Trichinella tj. Ad. Zmienność profilu białkowego obserwowana pomiędzy stadiami rozwojowymi Trichinella, jak również różnice w przebiegu inwazji wywołanej poszczególnymi gatunkami, były podstawą do podjęcia badań prowadzonych w ramach rozprawy doktorskiej. Celem badań była analiza profili białkowych stadiów ML1, a także produktów ES ML1 i Ad nicieni T. britovi i T. spiralis; identyfikacja białek immunoreaktywnych; uzyskanie wybranych białek T. britovi w formie rekombinowanej wraz z oceną ich przydatności jako potencjalnych markerów diagnostycznych włośnicy w teście ELISA. W przeprowadzonych w ramach rozprawy doktorskiej badaniach zidentyfikowano łącznie 52 białka specyficzne dla T. spiralis oraz 36 białek specyficznych dla T. britovi. Jako wspólne dla obu gatunków Trichinella zidentyfikowano 15 białek. W niniejszej pracy po raz pierwszy wykorzystano surowicę od pacjenta zarażonego włośniem do wykrywania metodą klasycznej dwukierunkowej elektroforezy (2DE) immunoreaktywnych białek w sekretomach T. spiralis i T. britovi. W wyniku przeprowadzonych analiz porównawczych obu gatunków wskazano grupę jedenastu białek rozpoznawanych przez surowice od pacjenta z 49 dnia po zarażeniu (dpz), które mogą posłużyć do udoskonalenia diagnozowania włośnicy u ludzi, w tym diagnostyki różnicującej zarażenie. Ponadto porównawcza analiza proteomiczna produktów ES osobników dorosłych T. britovi i T. spiralis pokazała, że zidentyfikowane białka pobudzają układ immunologiczny żywiciela już w 10 dpz, czyli we wczesnej fazie jelitowej, czyniąc je potencjalnymi markerami do wczesnego diagnozowania włośnicy. W niniejszej pracy zoptymalizowano i wdrożono wysoce czułą metodę 2D DIGE do analiz porównawczych ekstraktów białkowych ML1 T. spiralis i T. britovi. Wykonano ilościowe analizy różnicowe poziomu objętości (ang. volume ratio) pojedynczych spotów zawierających białka należące do ekstraktów stadium ML1 obu gatunków. Pozwoliło to na wskazanie 165 wspólnych spotów, oraz 31 spotów wśród których część była gatunkowo-specyficzna, a część charakteryzowała się różnych stopniem ekspresji między ekstraktami. Więcej spotów białkowych okazało się być specyficznych dla T. spiralis (23) niż dla T. britovi (8). Pokazano, że prowadzenie analiz porównawczych proteomów włośnia z wykorzystaniem 2D DIGE pozwala bardzo dobrze zwizualizować ich wzajemne podobieństwa jak i różnice, i stanowi atrakcyjną alternatywę do badań porównawczych prowadzonych z wykorzystaniem 2DE. Wykorzystując narzędzia bioinformatyczne przeanalizowano zidentyfikowane sekwencje kodujące i wybrano białka T. britovi, które następnie uzyskano w formie rekombinowanej: proteazę chymotrypsyno-podobną (CTRL), białko ekskrecyjno-sekrecyjne 21 kDa (ES21) oraz niskocząsteczkowe białko szoku cieplnego 20 kDa (HSP20). Do produkcji białek wykorzystano eukariotyczny system ekspresyjny Pichia pastoris, który dotychczas nie był stosowany w badaniach nad Trichinella. Przebadano użyteczność uzyskanych białek jako markerów serodiagnostycznych włośnicy do wykrywania przeciwciał w teście ELISA. Wykazano, że białko rTbCTRL jest najbardziej czułe w wykrywaniu swoistych przeciwciał IgG w surowicach pochodzących od świń zarażonych T. britovi. Białko rTbES21 natomiast, pomimo najniższej reaktywności z surowicami świń, było najbardziej specyficzne gatunkowo. Nieznaczne różnice zauważono w poziomie przeciwciał przy zastosowaniu kombinacji dwóch białek: rTbCTRL + rTbES21. Uzyskane wyniki wskazały na większą reaktywność białek rekombinowanych T. britovi z surowicami pochodzącymi od zwierząt zarażonych tym samym gatunkiem nicienia. Białka zidentyfikowane i przedstawione w rozprawie doktorskiej uzupełniły aktualny stan wiedzy o proteomie Trichinella wzbogacając go o białka immunoreaktywne należące do proteomu T. britovi, jak również białka charakterystyczne dla wczesnych stadiów rozwojowych T. spiralis i T. britovi. Uzyskane wyniki stanowią uzupełnienie bazy potencjalnych markerów diagnostycznych włośnicy. Tworzenie testów serologicznych z wykorzystaniem przedstawionych w pracy markerów mogłoby zwiększyć czułość i specyficzność metod immunodiagnostycznych obecnie stosowanych do wykrywania zarażenia Trichinella u ludzi i zwierząt.

Trichinellosis is a zoonotic disease caused by nematodes of the genus Trichinella. There are three stages in the life cycle of the nematode: adult worms (Ad), new born larvae (NBL) and invasive muscle larvae (ML1). Currently, ten species and three genotypes have been classified for the Trichinella genus. Two of the most common species present in Europe and Poland are T. spiralis and T. britovi. The main source of infection among humans is raw or undercooked meat containing Trichinella spp. larvae ML1. The animals that are a source of food for humans (pig and wild boar) are the most epidemiologically significant. Most cases of human infection are associated with T. spiralis, a highly-invasive cosmopolitan species. Nevertheless, T. britovi infection is becoming more common nowadays as a result of wild boar meat consumption. Commercial ELISA tests used in trichinellosis diagnosis base on antigenic excretory-secretory (ES) products of T. spiralis ML1, which are produced and excreted through glandular cells (stichocytes). These diagnostic tests can generate false results, due to the use of ES products of the final developmental stage of T. spiralis - ML1 as antigens, which makes it impossible to diagnose the early stage of the parasite invasion. It illustrates the low sensitivity and specificity of the antigen used in the commercial tests. Individual stages of Trichinella development are characterized by a different protein profile due to the parasite maturation processes and its migration between organs in the host organism. Therefore, it is crucial in the development of infection diagnostic tests to know the protein profiles of somatic antigens, as well as the ES products of the early developmental stages of Trichinella, i.e. Ad. The basis for undertaking research conducted as part of the doctoral dissertation were the variability of the protein profiles observed between the developmental stages of Trichinella, as well as the differences in the course of the invasion caused by individual species. The objectives of the study was an analysis of the protein profiles of the ML1 developmental stage, the ES products of ML1 and Ad stages of the nematodes T. britovi and T. spiralis; identification of immunoreactive proteins; obtaining selected T. britovi proteins in recombinant forms and testing their usefulness in ELISA as potential diagnostic markers of trichinellosis. The results presented in the doctoral dissertation show a total of 52 T. spiralis-specific proteins and 36 T. britovi-specific proteins. Fifteen proteins were found to be as common to both Trichinella species. In this dissertation, for the first time serum sample from a patient infected with Trichinella was used for the detection of immunoreactive proteins in the secretomes of T. spiralis and T. britovi with two dimensional electrophoresis (2DE). A group of eleven proteins recognized by patient sera from 49 days post infection (dpi) can be considered as proteins useful for improving the diagnosis of trichinellosis in humans, including differential diagnosis. Moreover, comparative proteomic analysis of T. spiralis and T. britovi Ad ES products showed that the identified proteins stimulate the host immune system as early as 10 dpi, i.e. in the early phase of intestinal infection, making them potential markers for the early diagnosis of trichinellosis. In the present work, a highly sensitive 2D DIGE method was optimized and implemented for comparative analyzes of T. spiralis and T. britovi ML1 protein extracts. Comparative analysis of the volume ratios of individual spots containing ML1 stage proteins of T. spiralis and T. britovi ML1 were performed. The 165 spots were identified as common to both T. spiralis and T. britovi, and 31 which were species-specific or characterized by different volume ratios between species. More protein spots were found to be specific for T. spiralis (23 spots) than for T. britovi (8 spots). The use of 2D DIGE was found to effectively visualize the slight similarities and differences between the two Trichinella proteomes and poses an attractive alternative to comparative analysis carried out with the use of 2DE. Identified coding sequences were analyzed with bioinformatics tools, and T. britovi proteins were selected and obtained in a recombinant form: chymotrypsin-like protease (CTRL), excretory secretory 21 kDa protein (ES21) and heat shock protein beta-1 (HSP20). The eukaryotic expression system of Pichia pastoris, never before applied in studies on Trichinella, has been used. To determine the suitability of chosen proteins as serodiagnostic markers of trichinellosis the ELISA tests were performed. The rTbCTRL protein was found to be the most sensitive in detecting specific IgG antibodies in sera from pigs infected with T. britovi. The rTbES21 protein, on the other hand, was the most species specific, despite demonstrating the lowest reactivity with antibodies in pig sera. Slight differences were noticed in the level of antibodies when using a combination of the two proteins rTbCTRL + rTbES21. The findings indicated that recombinant T. britovi proteins are of value in the serodiagnosis of trichinellosis in animals infected by the same species. In the doctoral dissertation, the current state of knowledge about the Trichinella proteome has been enriched with immunoreactive proteins belonging to the T. britovi proteome, as well as proteins characteristic of the early developmental stages of T. spiralis and T. britovi. The results complement the database of potential diagnostic markers of trichinellosis. The development of diagnostic tests using identified markers can increase the sensitivity and specificity of immunodiagnostic methods currently used to detect Trichinella infestation in humans and animals.