Determinacja losów blastomerów podczas formowania się pierwszych linii komórkowych w zarodku myszy

Rozdzielenie populacji komórek zewnętrznych i wewnętrznych, będących prekursorami odpowiednio trofektodermy (TE) i węzła zarodkowego (ICM) w zarodku myszy, ma miejsce w trakcie trzech tur asymetrycznych podziałów blastomerów w stadium 8-, 16- i 32-komórkowym. W ICM dochodzi następnie do wyodrębnienia komórek pierwotnej endodermy (PE) oraz epiblastu (EPI). Celem niniejszej rozprawy była odpowiedź na pytanie, jakie czynniki determinują różnicowanie tych linii komórkowych w przedimplantacyjnym zarodku myszy.W CZĘŚCI 1. mojej pracy analiza ekspresji genów specyficznych dla EPI i PE w pojedynczych komórkach wewnętrznych 32-komórkowego zarodka, wywodzących się z I i II rundy podziałów asymetrycznych, ujawniła różnice w transkrypcji Fgf4 i jego receptora Fgfr2. Pomimo tych różnic agregaty 32-komórkowe złożone wyłącznie z blastomerów wywodzących się z I lub II tury podziałów asymetrycznych tworzyły prawidłowe blastocysty. Zauważyłam także odwrotną korelację między częstością podziałów asymetrycznych zachodzących podczas I i II rundy, co w konsekwencji wpływało na regulację proporcji komórek wewnętrznych i zewnętrznych w zarodku.W CZĘŚCI 2. doświadczeń chciałam sprawdzić, czy pochodzenie komórek wewnętrznych (z I lub II rundy podziałów asymetrycznych) determinuje następnie kierunek ich różnicowania w linie EPI lub PE. Analiza blastocyst uzyskanych w wyniku hodowli 16-komórkowych agregatów o różnym stosunku komórek zewnętrznych do wewnętrznych pokazała, że los komórek wewnętrznych nie zależy od tury podziałów asymetrycznych, z której się wywodzą, ale od liczby blastomerów wewnętrznych generowanych w I rundzie podziałów asymetrycznych.Aby sprawdzić, czy oddziaływania między blastomerami odpowiadają za regulację częstości podziałów asymetrycznych w I i II rundzie w CZĘŚCI 3. badań do zarodków 8-komórkowych wprowadzałam zarodkowe komórki macierzyste ES. Stwierdziłam, że obecność w zarodku tych dodatkowych komórek o charakterze wewnętrznym prowadziła do zmniejszenia częstości podziałów asymetrycznych blastomerów w I i III turze w porównaniu do zarodków kontrolnych. W późnych blastocystach wraz ze wzrostem liczby komórek ES malał udział komórek własnych zarodka w budowie EPI, a rósł w PE, za co mogą odpowiadać oddziaływania parakrynowe, np. Fgf4 wydzielany przez komórki ES. Uzyskane w CZĘŚCIACH 1.-3. rozprawy wyniki posłużyły mi do opracowania nowatorskiego modelu różnicowania komórek w ICM. W CZĘŚCI 4. pracy podjęłam się zbadania wpływu pozycji i polaryzacji komórek w zarodku 16-komórkowym na ich późniejszy los. Zauważyłam, że blastomery wewnętrzne (niepolarne) charakteryzowały się dużą plastycznością i po zmianie lokalizacji na powierzchniową w eksperymentalnych agregatach mogły się przeprogramować i różnicować ostatecznie w TE. Z kolei w agregatach, w których blastomer zewnętrzny (polarny) umieszczany był w środku, śledzona komórka przemieszczała się na powierzchnię. Proces ten prawdopodobnie nie miał charakteru aktywnego, ponieważ zaburzenie polimeryzacji aktyny nie hamowało migracji tej komórki.

In the mouse embryo separation of outer and inner cell populations, precursors of trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM), respectively, occurs during three waves of asymmetric divisions at the 8-, 16- and 32-cell stage. Subsequently, cells within ICM differentiate into the primitive endoderm (PE) and the epiblast (EPI). The aim of my doctoral dissertation was to address the question, what factors are responsible for the differentiation of these cell lineages in the mouse preimplantation embryo.In the first part analysis of expression of genes specific for EPI and PE in single inner cells of 32-cell embryo, originating from the first or the second round of asymmetric divisions, unveiled differences in transcription of Fgf4 and its receptor Fgfr2. Despite these differences 32-cell aggregates composed only of blastomeres derived from the first or the second wave of asymmetric divisions developed into normal blastocysts. Additionally, I found a reverse correlation between the frequency of the first and the second round of asymmetric divisions, which regulated the proportions between inner and outer cells in the embryo.In the second part of my doctoral thesis I aimed at answering the question whether the time of generation of inner cells determines their further differentiation into EPI or PE. Analysis of blastocysts obtained from 16-cell aggregates constructed with different ratios of outer to inner cells showed that the fate of inner cells does not depend on the time of internalization, but on the number of inner blastomeres generated in the first round of asymmetric divisions.In order to investigate whether the interactions between blastomeres regulate the relation between the frequency of asymmetric divisions in the first and the second wave in the third part of my dissertation I introduced embryonic stem cells (ESCs) into 8-cell stage embryos. I found that the presence of these additional “inner-like” cells led to a decrease of frequency of asymmetric divisions in the first and the third round. I found that in late blastocysts with increasing number of ESCs, the contribution of embryo cells to the EPI lineage decreased and they became restricted to PE. I hypothesize that Fgf4 secreted by ESCs is probably responsible for specification of embryo cells into this lineage in chimaeric blastocysts. Based on these results I proposed a novel model of EPI and PE specification.In the fourth part of my thesis I investigated the role of position and polarization of cells in the 16-cell embryo in determination of their later fate. I observed that inner (apolar) blastomeres exhibited great plasticity after placing them outside of experimental aggregates, since they changed their fate and differentiated into the TE lineage. On the other hand, outer (polar) cell tended to move from the inside to the surface of aggregates. Observed migration was probably a passive process, because inhibition of actin polymerization did not impair the motility of the followed cell.