Influence of different sample preparation techniques on imaging of viruses and virus-like particles in modern carbonate settings by scanning electron and scanning transmission electron microscopes

Współczesna nauka, mając charakter interdyscyplinarny, wymaga często od specjalistów z różnych dziedzin wykroczenia poza obszar własnej specjalizacji. Chcąc prowadzić badania na tak małych cząstkach jak wirusy, pojawia się potrzeba sporządzenia protokołów eksperymentalnych, które ułatwią pracę z wymagającym materiałem biologicznym ze środowiska naturalnego, w tym środowisk sedymentacyjnych. W niniejszej pracy magisterskiej, opublikowanej w formie artykułu naukowego we Frontiers in Microbiology, opisano trzy przykładowe procedury przygotowywania preparatów wirusowych w celu ich analizy pod mikroskopem elektronowym. Procedury te zostały rozszerzone o sposób izolacji peletu wirusowego z biofilmu porastającego współcześnie tworzące się słodkowodne utwory węglanowe. Procedury te zostały sporządzone na podstawie dotychczas opublikowanych metod obrazowania materiału biologicznego pod mikroskopem elektronowym (głównie transmisyjnym mikroskopie elektronowym). Zostały one dostosowane do charakteru posiadanych próbek biofilmów i czystych bakteriofagów oraz do obrazowania w skaningowym (skaningowo-transmisyjnym) mikroskopie elektronowym. Dwie z opisanych procedur (procedura pełna oraz uproszczona) mogą być z powodzeniem stosowane do przygotowywania wspomnianych preparatów mikroskopowych. Procedura trzecia („wszystko na raz”) ujawniła wiele wad, które pozwalają zaobserwować błędy jakie można popełnić przy przygotowywaniu preparatów mikroskopowych. Każda z tych procedur ma nieocenioną wartość ukazując szczegóły i wygląd cząstek wirusowych, wirusopodobnych oraz artefaktów po zastosowanych odczynnikach chemicznych, czy nawet minerałów pochodzących ze środowiska pobranego biofilmu.

Modern science, being interdisciplinary in nature, often requires specialists from different fields to exceed their own area of expertise. When conducting research on such small entities as viruses, there is a need to develop experimental protocols that facilitate working with demanding biological material from natural environments, including sedimentary environments. In this master's thesis, published as a scientific paper in Frontiers in Microbiology, three example procedures for preparing viral specimens for analysis under an electron microscope are described. These procedures have been enriched in procedure of viral pellet isolation from biofilms growing on modern freshwater carbonate formations. They are based on previously published methods for imaging biological material under an electron microscope (mainly transmission electron microscopy) and adapted to the nature of the biofilm samples and pure bacteriophages, as well as to imaging in scanning (scanning-transmission) electron microscopy. Two of the described procedures (the full procedure and the simplified procedure) can be successfully used to prepare the mentioned microscopic sample. The third procedure (all at once) revealed many shortcomings, which highlight the errors that can be made while preparing microscopic sample. Each of these procedures is invaluable in showing details and the appearance of viral particles, virus-like particles, and artifacts resulting from the application of chemical reagents or even minerals that came from the sampled biofilm's environment.