Konstrukcja i charakterystyka uniwersalnego bakteryjnego wektora do wykorzystania w szczepionkach nowej generacji

Zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za wywoływanie odpowiedzi immunologicznej ma kluczowe znaczenie w generowaniu odporności przeciw wszystkim patogenom. Największe wyzwanie stanowi wywołanie odporności przeciw patogenom namnażającym się wewnątrzkomórkowo, które są przyczyną chorób takich jak: AIDS, malaria czy gruźlica, prowadzących do stale wzrastającej liczby zgonów. W przeciwieństwie do zewnątrzkomórkowych czynników chorobotwórczych, są one mniej widoczne dla układu immunologicznego, co powoduje, że do ich eliminacji niezbędne jest zajście komórkowej odpowiedzi immunologicznej, której efektorami są limfocyty pomocnicze CD4+ i cytotoksyczne CD8+. Efektywną metodą prowadzącą do aktywacji cytotoksycznych limfocytów T jest dostarczenie antygenu do cytoplazmy komórki prezentującej antygen. Istnieją różne strategie wprowadzania antygenów do cytozolu tj.: wykorzystanie nanocząstek, wirusów czy patogennych lub niepatogennych bakterii. Jedną z obiecujących i intensywnie badanych strategii jest wykorzystanie komórek bakteryjnych. Wyniki badań wstępnych wskazują, że bakteria Bacillus subtilis stanowi doskonały wektor nośnikowy dla heterologicznych antygenów, ze względu na zdolność do bardzo efektywnej sekrecji białek na zewnątrz komórki, niepatogenność, znajomość genetyki oraz niskie koszty hodowli. W toku eksperymentów z wykorzystaniem B. subtilis wykazano, że ekspresja genu kodującego listeriolizynę O umożliwia wnikanie do wnętrza komórek eukariotycznych oraz wyswobodzenie się z ich wakuoli do cytoplazmy, a także, że koekspresja LLO z innymi antygenami w wektorach bakteryjnych przyczynia się do zwiększonej odpowiedzi immunologicznej. Cechy te przemawiają za tym, że B. subtilis może spełniać funkcję nośnika antygenów i umożliwiać zgłębienie procesu indukcji komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Hipoteza badawcza przedstawianej rozprawy doktorskiej zakłada, że B. subtilis wytwarzający jednocześnie sekrecyjne formy LLO i danego heterologicznego antygenu będzie skutecznie dostarczał antygen bezpośrednio do cytozolu komórki prezentującej, umożliwiając tym samym jego prezentację w kompleksach MHC klasy I i indukcję odpowiedzi komórkowej. Przedstawiona rozprawa doktorska stanowi próbę stworzenia nowatorskiego i uniwersalnego wektora szczepionkowego na bazie B. subtilis wywołującego odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw dowolnemu białku. Pierwsza jej część dotyczy konstrukcji plazmidowych wektorów umożliwiających uzyskiwanie szczepów B. subtilis wytwarzających sekrecyjną formę danego antygenu. W toku eksperymentów otrzymano zarówno wektor umożliwiający fakultatywną, zależną od obecności induktora w podłożu hodowlanym ekspresję antygenów, jak i wektor umożliwiający konstytutywną syntezę. Potwierdzono zdolność otrzymanych plazmidów do inkorporacji do chromosomu B. subtilis oraz zwiększoną efektywność transformacji do komórek kompetentnych, co przyczyniło się do znacznego uproszczenia procesu uzyskiwania modyfikowanych szczepów B. subtilis produkujących heterologiczne białka. Opisane w pierwszej części rozprawy doktorskiej wektory posłużyły jako baza do stworzenia szczepów bakteryjnych wytwarzających heterologicznie prokariotyczne oraz eukariotyczne białka. Ich zdolność do wywoływania prezentacji antygenu na komórkach APC i specyficznej, ukierunkowanej przeciw danemu antygenowi odpowiedzi immunologicznej analizowano w drugiej części przedstawionej pracy. Pierwszym jej etapem było uzyskanie szczepów B. subtilis wytwarzających owoalbuminę jaja kurzego, która jest modelowym antygenem eukariotycznym. Antygen ten wytypowano ze względu na dostępność zaawansowanych narzędzi molekularnych umożliwiających ocenę potencjału immunologicznego oraz powszechność użycia go w badaniach. Stworzono szczepy wytwarzające fuzyjny antygen LLO-OVA powstały poprzez połączenie pełnej formy lub N terminalnej części listeriolizyny O niosącej sekwencje: sygnałową i PEST-podobną z pełnej długości lub fragmentaryczną owoalbuminą. Analiza produkcji różnych form białka fuzyjnego LLO-OVA miała na celu wytypowanie struktury genetycznej przyczyniającej się do wzbudzenia najefektywniejszej prezentacji antygenu i najsilniejszej odpowiedzi immunologicznej. W toku badań sprawdzono zdolność uzyskanych szczepów do wnikania do cytozolu komórek APC i dostarczania antygenu, określono poziom prezentacji epitopu OVA oraz aktywacji limfocytów cytotoksycznych rozpoznających epitop OVA w kontekście MHC I. Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że jedynie ekspresja pełnej długości OVA poddanej fuzji do N-końcowej sekwencji LLO w B. subtilis umożliwia zajście skutecznej prezentacji antygenu na komórkach dendrytycznych, prowadzącej do aktywacji cytotoksycznych limfocytów T. Sekrecja epitopu OVA w fuzji z pełnej długości LLO bądź jej N-końcową sekwencją nie prowadzi do zajścia komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Badania opisane tej części dowiodły ponadto, że B. subtilis jest skutecznym wektorem szczepionkowym dostarczającym antygeny eukariotyczne i indukującym ich prezentację w kompleksach z układami zgodności tkankowej. Wytypowana struktura genetyczna antygenu heterologicznego została zastosowana przy konstrukcji szczepów B. subtilis wytwarzających główny antygen bakterii M. tuberculosis, transferazę mykolylową 85B (Ag85B). Analiza zdolności szczepów B. subtilis do immunizacji myszy przeciwko M. tuberculosis jest integralną częścią opisanych w rozprawie badań. Gruźlica w ostatnich czasach znalazła się w czołówce najgroźniejszych chorób, a od kilku lat obserwuje się postępujący wzrost zachorowań. Do tej pory nie opracowano skutecznej metody immunizacji powodującej trwałą i silną odporność przeciw gruźlicy, więc zastosowanie żywych wektorów szczepionkowych na bazie niepatogennej bakterii do immunizacji stanowi obiecujący i silnie eksplorowany trend współczesnej wakcynologii. W części rozprawy doktorskiej poświęconej konstrukcji szczepionki przeciwgruźliczej uzyskano dwa szczepy konstytutywnie lub fakultatywnie produkujące Ag85B. Po potwierdzeniu zdolności do sekrecji heterologicznego białka poza komórkę bakteryjną, przeprowadzono szeroką analizę immunogenności in vivo. Myszy seryjnie szczepiono bakteriami, a ich splenocyty oraz surowica krwi posłużyły do określenia typu zachodzącej odpowiedzi immunologicznej. Analizy nieoczekiwanie wykazały, że oba analizowane szczepy B. subtilis nie prowadzą do aktywacji mediatorów odpowiedzi komórkowej, jakimi są limfocyty Tc. Immunizacja szczepem konstytutywnie wytwarzającym gruźliczy antygen prowadzi natomiast do zwiększenia poziomu całkowitej immunoglobuliny IgG, co świadczy o zajściu humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Rozbieżność wyników analiz z wykorzystaniem szczepów eksprymujących białko OVA i Ag85B sugeruje, że natura eksprymowanego antygenu może wpływać na typ generowanej odpowiedzi odpornościowej, jednak hipoteza ta musi być zweryfikowana poprzez przeprowadzenie odpowiednich dalszych badań. Podsumowując, przeprowadzone badania dowiodły, że wykorzystanie wegetatywnych komórek B. subtilis w immunizacji jest obiecującą perspektywą współczesnej wakcynologii. Wektory szczepionkowe uzyskiwane na bazie szczepu MB4 są zdolne do efektywnej produkcji oraz sekrecji zarówno eukariotycznych, jak i prokariotycznych białek, co może mieć przełożenie na zdatność ich wykorzystania do indukcji zarówno komórkowych, jak i humoralnych mechanizmów odporności nabytej.

Understanding the mechanisms responsible for the induction of the immune response is crucial in the development of immunity against pathogens. However, to elicit an effective response against various tumor-associated antigens or intracellular pathogens, the causative agents of highly prevalent and morbid diseases worldwide, such as AIDS, malaria, and tuberculosis, poses a serious challenge to the modern vaccinology. In contrast to extracellular pathogens, those living inside host cells are less visible to the immune system, so that the major protective mechanism is provided by a cellular response involving both CD4+ and CD8+ T cells. An efficient way leading to the activation of cytotoxic T cells is the delivery of an antigen into the cytoplasm of the antigen presenting cells (APCs). Various strategies to introduce antigens into the cytosol are known, i.e.: the use of nanoparticles, viruses or pathogenic or non-pathogenic bacteria. The promising and intensively investigated strategy is to use bacterial cells. Preliminary studies indicate that the bacterium Bacillus subtilis is an ideal carrier vector for heterologous antigens, due to its ability to highly efficient protein secretion, non-pathogenicity, knowledge of the bacterium genetics and low cultivation costs. Experiments with B. subtilis prove that the expression of the gene encoding listeriolysin O (LLO) allows the penetration into the cytosol of eukaryotic cells and escape from the vacuole into the cytoplasm, and that co-expression of LLO with other antigens in a bacterial vectors contributes to an increased immune response. Thanks to these features, B. subtilis can be used as a carrier of antigens that allows exploration of the process of induction of the cellular immune response. Research hypothesis of the presented doctoral dissertation implies that B. subtilis producing secreted form of LLO and the heterologous antigen at the same time is effectively delivered directly to the cytosol of antigen presenting cells (APCs), thus allowing the presentation of complexes of MHC class I and induction of cellular response. The presented thesis is an attempt to create an innovative and versatile vector-based B. subtilis vaccine inducing an immune response directed against any protein. The first part concerns the construction of plasmid vectors and strains of B. subtilis producing a secreted form of the antigen. Vectors enabling facultative or constitutive expression of the antigens were constructed and their capacity to incorporate into the chromosome of B. subtilis and transformation efficiency were measured, what consequently contributed to a significant simplification of the process of obtaining modified strains of B. subtilis producing heterologous proteins. Vectors described in the first part of the thesis were used as a base for construction of the bacterial strains heterologously producing prokaryotic and eukaryotic proteins. Their ability to induce presentation of the antigen on the surface of APCs and the specific immune response directed against a given antigen was analysed in the second part of the presented work. Firstly, strains of B. subtilis producing a model eukaryotic antigen, chicken egg ovalbumin (OVA), were constructed. The OVA antigen was selected because of its universality, as well as availability of advanced molecular tools to assess its immunogenicity. A set of strains co-expressing different domains of LLO and OVA as fusion products, of different lengths, was designed. The aim of analysis of the production of various forms of LLO-OVA fusion protein was to predict the genetic structure which contributes to the excitation of the most efficient antigen presentation and the strongest immune response. The study examined the ability of the obtained strains to penetrate into the cytosol of APCs and deliver the antigen, as well as the level of the OVA epitope presentation and activation of cytotoxic T lymphocytes recognizing the epitope in the context of MHC I. The results of tests showed that the sequence context of the epitope is of great importance, as only native, full-size OVA fused to N-terminal fragment of LLO was sufficient for potent epitope delivery and activation of the CD8+ lymphocytes. Additionally, it was proven that B. subtilis is an effective vaccine vector supporting the delivery of eukaryotic antigens and inducing their presentation in complexes with the MHC. The genetic construct capable of inducing cellular response chosen in the previous part of the study was used to design the bacterial vector producing Ag85B, one of the main Mycobacterium tuberculosis antigens. Recently, tuberculosis has been one of the deadliest diseases, and for several years there has been a progressive increase in incidence. To date, no effective method of immunization resulting in a durable and strong immunity against tuberculosis was developed, so the use of live vaccine vectors based on non-pathogenic bacteria for immunization is a promising and highly explored trend of modern vaccinology. Strains of B. subtilis expressing the mycobacterial antigen either inducibly or consitutively were obtained, thereby allowing a comparison of the capability of antigen delivery to antigen-presenting cells in vivo. The main objective was to determine if serial vaccination of mice with the B. subtilis recombinant strains would result in the generation of memory T cell population, activated upon recognition of Ag85B. Surprisingly, the analyses did not prove the ability of the vector to induce cellular immune response. However, increased level of Ag85B-specific IgG antibodies in serum of mice vaccinated with a strain constitutively expressing Ag85B was observed, indicating humoral immune response. The discrepancy of the results of analyzes using strains expressing OVA or Ag85B protein suggests that the nature of the expressed antigen may influence the type of generated immune response, but this hypothesis must be verified by conducting appropriate further study. In summary, the study revealed that the use of vegetative cells of B. subtilis in immunization is a promising perspective of modern vaccinology. B. subtilis MB4 derived vaccine vectors are capable of efficient production and secretion of eukaryotic and prokaryotic proteins, which may have impact on the fitness of their use to induce both cellular and humoral mechanisms of acquired immunity.