Stabilizacja aktywnej błonowo struktury peptydów oraz ich koniugacja z aminoglikozydami jako strategie poprawy aktywności przeciwbakteryjnej tych związków

Narastający problem wielolekoopornych bakterii oraz malejąca skuteczność istniejących terapii zwiększyły zapotrzebowanie na opracowanie nowych związków o działaniu przeciwbakteryjnym. Ostatnie badania wykazały, że stabilizacja struktury drugorzędowej peptydów aktywnych błonowo korzystnie wpływa na ich zdolność do degradacji błon komórkowych bakterii, co jest powiązane ze wzrostem ich aktywności przeciwbakteryjnej. Ponadto, koniugacja dwóch związków może prowadzić do wzmocnienia ich działania. W oparciu o te założenia zdefiniowano główne cele pracy doktorskiej: zwiększenie aktywności peptydów poprzez chemiczną stabilizację ich struktury drugorzędowej oraz poprawa skuteczności aminoglikozydów wobec opornych szczepów bakterii poprzez ich koniugację z peptydami aktywnymi błonowo. Po pierwsze, przeprowadzono reakcję węglowodorowego „zszywania”, polegającą na wprowadzeniu nienaturalnych aminokwasów po hydrofobowej stronie amfipatycznej helisy peptydu, które następnie połączono, tworząc „zszywkę”. Zmodyfikowane analogi anopliny wykazały od 2 do 16 razy wyższą aktywność przeciwbakteryjną wobec różnych szczepów bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Analiza widm spektroskopii dichroizmu kołowego potwierdziła ich α-helikalną strukturę, która korelowała ze wzrostem aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz stabilności proteolitycznej. Badania z użyciem jodku propidyny wykazały, że inhibicja wzrostu bakterii przez „zszyte” analogi anopliny wynika z ich zdolności do niszczenia błon komórkowych bakterii. Szczególnie obiecującym analogiem okazała się anoplina ze „zszywką” w pozycjach 2 i 6, która wykazywała aż 8-krotnie wyższą aktywność przeciwbakteryjną wobec opornych szczepów E. coli. Dodatkowo, charakteryzowała się zwiększoną stabilnością proteolityczną, przy niskiej aktywności hemolitycznej i minimalnej toksyczności wobec komórek eukariotycznych. Po drugie, modyfikacja w postaci „zszywania” umożliwiła nabycie właściwości przeciwbakteryjnych przez peptyd (KFF)3K o penetrujących cechach, który wcześniej nie wykazywał aktywności w stężeniach do 32 µM. „Zszyte” analogi tego peptydu osiągnęły aktywność w zakresie od 2 do 16 µM. Analiza spektroskopii dichroizmu kołowego oraz symulacje dynamiki molekularnej wykazały, że „zszywanie” indukuje α-helikalną strukturę analogów (KFF)3K w środowisku lipidowym. Ponadto, modyfikacja poprawia stabilność proteolityczną peptydów wobec α-chymotrypsyny. Badania wykazały, że technika „zszywania” skutecznie aktywuje przeciwbakteryjne działanie peptydu (KFF)3K o właściwościach penetrujących, poprzez indukcję jego struktury helikalnej. Po trzecie, aby zwiększyć skuteczności antybiotyków aminoglikozydowych wobec szczepów opornych, przeprowadzono koniugację peptydów (anopliny oraz jej zmodyfikowanej wersji „zszytej” w pozycjach 2 i 6) z aminoglikozydami (neomycyną i amikacyną). Koniugaty aminoglikozyd-peptyd zostały zsyntezowane przy użyciu dwóch metod: tworzenia pierścienia triazolowego oraz wiązania disulfidowego. Koniugaty z neomycyną, połączone za pomocą redukowalnego wiązania disulfidowego, wykazały 2-krotnie większą skuteczność w hamowaniu wzrostu bakterii w porównaniu do koniugatów z nierozszczepialnym linkerem. Niemniej jednak koniugaty te jedynie nieznacznie poprawiły aktywność przeciwbakteryjną, szczególnie wobec szczepów opornych na amikacynę i neomycynę, co może wynikać z faktu, że „zszyty” peptyd samodzielnie wykazywał już wyższą aktywność. Badania przeprowadzone w ramach tej pracy doktorskiej wykazały, że stabilizacja i aktywacja helikalnej struktury w przypadku peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz penetrujących komórki za pomocą węglowodorowego „zszywania” znacząco poprawia ich aktywność przeciwbakteryjną. Udowodniono, że ta strategia stanowi skuteczne narzędzie w projektowaniu nowych związków o właściwościach przeciwbakteryjnych.

The growing problem of multidrug-resistant bacteria and the decreasing efficacy of existing therapies have increased the need to develop new compounds with antimicrobial activity. Recent studies have shown that stabilization of the secondary structure of membrane active peptides positively affects their ability to disrupt bacterial cell membranes, which is associated with an increase in their antimicrobial activity. Furthermore, conjugation of the two compounds may lead to an enhancement of their activity. Based on these presumptions, the main objectives of the thesis were defined as follows: to increase the activity of peptides by chemical stabilization of their secondary structure and to improve the efficacy of aminoglycosides against resistant bacterial strains by conjugation with membrane-active peptides. Firstly, a hydrocarbon stapling reaction was performed, in which unnatural amino acids were introduced to the hydrophobic side of the peptide's amphipathic helix and then linked together to form a staple. The modified anoplin analogs showed 2 to 16 times higher antibacterial activity against various strains of Gram-positive and Gram-negative bacteria. Circular dichroism spectroscopy analysis confirmed α-helical structure of synthesized peptides, which correlated with an increase in their antimicrobial activity and proteolytic stability. Studies using propidium iodide have shown that the inhibition of bacterial growth by stapled anoplin analogs is due to their ability to disrupt bacterial cell membranes. One of the particularly promising analogs turned out to be an anoplin with a staple at positions 2 and 6, which showed up to 8-fold higher antimicrobial activity against resistant E. coli strains. In addition, it was characterized by an increased proteolytic stability, with a low hemolytic activity and minimal toxicity to eukaryotic cells. Secondly, the staple modification enabled the acquisition of antimicrobial properties by a peptide (KFF)3K with penetrating properties that previously lacked activity at concentrations up to 32 µM. Stapled analogs of this peptide achieved activity in the range of 2 to 16 µM. Circular dichroism spectroscopy analysis and molecular dynamics simulations showed that stapling induces the α-helical structure of (KFF)3K analogs in a lipid environment. The modification also improves peptides’ proteolytic stability against α-chymotrypsin. These studies confirm that the stapling technique effectively initiates the antimicrobial activity of the penetrating peptide (KFF)3K by inducing its helical structure Thirdly, to increase the efficacy of aminoglycoside antibiotics against resistant strains, conjugation of peptides (anoplin and its stapled version at positions 2 and 6) with aminoglycosides (neomycin and amikacin) was performed. Aminoglycoside-peptide conjugates have been synthesized using two methods: triazole ring formation and disulfide bonds. Conjugates with neomycin linked by a cleavable disulfide bond were 2-fold more effective at inhibiting bacterial growth than conjugates with a non-cleavable linker. However, these conjugates only slightly improved antimicrobial activity, especially against strains resistant to amikacin and neomycin, which may be explained by the high activity of the peptide itself. Research conducted as part of this thesis has shown that stabilization and activation of the helical structure of antimicrobial and cell-penetrating peptides via hydrocarbon stapling significantly improves their antimicrobial activity. This strategy has proven to be an effective tool in the design of new compounds with antimicrobial properties.