Peptydowe hydrożele funkcjonalizowane interleukiną 4 jako narzędzie wspomagające regenerację mięśni szkieletowych i zwiększające właściwości terapeutyczne prekursorowych komórek miogenicznych

Mięśnie szkieletowe charakteryzują się zdolnością do regeneracji po urazie. Jest to możliwe dzięki obecności populacji unipotencjalnych komórek macierzystych określanych jako komórki satelitowe (SCs, ang. satellite cells). W fizjologicznych warunkach SCs pozostają w stanie uśpienia, jednak, gdy dochodzi do uszkodzenia mięśni, komórki te ulegają aktywacji i rozpoczynają podziały. Część z nich podejmuje różnicowanie miogeniczne i w wieloetapowym procesie finalnie formuje włókna mięśniowe. Inne pozostają w stanie niezróżnicowanym, odtwarzając pulę SCs. Pozwala to zachować odpowiednio liczną populację SCs, niezbędną do zajścia kolejnej rundy regeneracji mięśnia szkieletowego. W prawidłowo funkcjonującym organizmie regeneracja mięśni przebiega sprawnie, jednak proces ten może zostać zakłócony w wyniku rozległych urazów, zmian związanych ze starzeniem się organizmu bądź rozwojem choroby. Do najpoważniejszych chorób wpływających na funkcję i regenerację mięśni szkieletowych zalicza się dystrofie mięśniowe, m. in. dystrofię mięśniową Duchenne’a (DMD). Mimo postępów nauki, metody leczenia rozległych uszkodzeń mięśni lub wspomagania regeneracji u pacjentów dotkniętych DMD lub innymi chorobami mięśni wciąż są ograniczone. Jednym z testowanych od lat pomysłów jest wykorzystanie komórek o potencjale miogenicznym. Problem stanowi jednak niska przeżywalność przeszczepianych komórek oraz ich ograniczona zdolność do zasiedlania miejsca urazu czy efektywnego formowania nowych włókien mięśniowych. Z tego względu obecnie główny nurt badań koncentruje się na opracowaniu metod "wspomagania" przeszczepianych komórek. Jedną z nich jest wykorzystanie biomateriałów, wśród których szczególne miejsce zajmują hydrożele, które mogłyby służyć jako rusztowanie dla przeszczepianych komórek, tworząc warunki sprzyjające ich przeżyciu, różnicowaniu oraz integracji z tkanką biorcy. Co więcej, hydrożele mogą być również wykorzystane jako nośniki czynników pozytywnie wpływających na endogenne lub przeszczepiane komórki oraz wspomagających procesy naprawcze uszkodzonej tkanki. Badania przeprowadzone w ramach mojej pracy doktorskiej miały na celu określenie wpływu nowo zaprojektowanych i zsyntetyzowanych hydrożeli funkcjonalizowanych fragmentem interleukiny 4 (IL-4) na rekonstrukcję mięśni szkieletowych. Analizowałam zarówno wpływ tych hydrożeli na populacje komórek obecnych w mięśniu szkieletowym i zaangażowanych w proces jego regeneracji, takich jak mioblasty izolowane z mięśni szkieletowych, fibroblasty, komórki śródbłonka, jak i na mioblasty (określane w literaturze przedmiotu także terminem prekursorowe komórki miogeniczne) uzyskane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (MBs-iPSCs, ang. induced pluripotent stem cell derived myoblasts). iPSCs budzą duże nadzieje na ich wykorzystanie w praktyce klinicznej. Łączą bowiem w sobie duży potencjał do proliferacji z możliwością różnicowania się w komórki mięśni szkieletowych (a także innych tkanek i narządów). Dodatkowo, mogą być otrzymywane z komórek pacjenta, późniejszego biorcy przeszczepu, co eliminuje ryzyko wystąpienia reakcji immunologicznej. W trakcie badań wykazałam, że 2 peptydy, IL-4-X i IL-4-Y, syntetycznie otrzymane i stanowiące fragmenty IL-4, używane na dalszych etapach badań do funkcjonalizacji hydrożeli, mają zdolność wiązania się z receptorem dla IL-4 obecnym na powierzchni komórek, a także aktywują ścieżkę sygnałową STAT6 zależną od IL-4. W dalszej części badań potwierdziłam, że zarówno ludzkie mioblasty uzyskane z mięśni szkieletowych, jak i MBs-iPSCs hodowane na hydrożelach uzyskanych z połączenia wyjściowego hydrożelu określanego jako R1 lub R4, z IL-4-X lub IL 4-Y (R1-IL4-X, R1-IL4-Y, R4-IL4-X, R4-IL4-Y), wydajnie różnicowały w wielojądrowe miotuby, czemu towarzyszyła prawidłowa ekspresja genów charakterystycznych dla kolejnych stadiów różnicowania miogenicznego. W oparciu o wyniki badań in vitro wytypowałam hydrożel, który miał najlepszy wpływ na komórki. Był to hydrożel R4-IL4-Y. Transplantacja w/w hydrożelu, samego lub razem z zawieszonymi w nim MBs-iPSCs, do uszkodzonego mięśnia myszy doprowadziła do wzrostu poziomu ekspresji czynników odpowiedzialnych za miogenezę, angiogenezę oraz tworzenie połączeń nerwowo-mięśniowych, przyczyniając się do polepszenia procesu regeneracji mięśnia. Uzyskane wyniki sugerują, iż badane hydrożele mają potencjał do wykorzystania w praktyce klinicznej.

Skeletal muscles are characterized by the ability to regenerate after injury. This regenerative capacity is primarily attributed to the presence of a population of unipotent stem cells known as satellite cells (SCs). Under physiological conditions, SCs remain in a quiescent state, however, upon injury, they become activated and start to proliferate. A subset of these cells undergoes myogenic differentiation, a multistep process that ultimately leads to the formation of new muscle fibers. Others sustain their undifferentiated state, thereby replenishing the SCs pool. This ensures the maintenance of a sufficient SCs population, which is essential for supporting potential subsequent rounds of skeletal muscle regeneration. In a healthy organism muscle regeneration occurs efficiently. Nevertheless, this process can be impaired in the case of severe injuries or as a consequence of age-related changes or disease progression. Among the most severe disorders affecting skeletal muscle function and regenerative capacity are muscular dystrophies, including Duchenne's muscular dystrophy (DMD). Despite advances in biomedical research, therapeutic strategies for treating extensive muscle injuries or enhancing regeneration in patients with DMD or other skeletal muscle diseases remain limited. One of the ideas explored over the years involves cell-based therapies utilizing myogenic progenitor cells. However, these strategies face significant challenges, including low survival rates of transplanted cells, their limited capacity to engraft at the injury site or to effectively contribute to the formation of new muscle fibers. For this reason, current research in this area is primarily focused on developing methods to enhance the efficacy of transplanted cells. One of the proposed strategy involves the use of various biomaterials, among which hydrogels have garnered particular interest as they could serve as scaffolds for transplanted cells, providing a microenvironment that promotes their survival, differentiation, and integration into host tissue. Moreover, hydrogels can also be engineered to act as carriers for bioactive molecules, thereby further supporting reconstruction of damaged tissue. The aim of this PhD thesis was to evaluate the impact of newly designed and synthesized hydrogels functionalized with an interleukin-4 fragment (IL-4) on skeletal muscle reconstruction. The analysis focused on the effects of these hydrogels on both resident cell populations involved in muscle reconstruction (myoblasts isolated directly from muscle, fibroblasts, endothelial cells) as well as on myoblasts (also described in related publications as myogenic precursors cells) derived from induced pluripotent stem cells (MBs-iPSCs). iPSCs are considered as a promising source of cells for clinical application due to their high capacity for proliferation, differentiation into skeletal muscle cells (as well as other tissues and organs). Additionally, they may be derived from cells of a later graft recipient, which reduces the risk of an immune response. The experiments conducted by me demonstrated that 2 peptides, IL-4-X and IL-4-Y, synthetically engineered and constituting IL-4 fragments, used in further studies for hydrogel functionalization, can bind to IL-4 receptors present on the cell surface and activate the IL-4 depend signaling pathway - STAT6. In further research I showed that both myoblasts isolated from skeletal muscles as well as MBs-iPSCs cultured on tested hydrogels composed of the initial hydrogel, described as R1 or R4 and IL-4 fragments IL-4-X lub IL-4-Y (R1-IL4-X, R1-IL4-Y, R4-IL4-X, R4-IL4-Y) underwent differentiation into elongated, multinucleated myotubes, what was accompanied by proper expression of genes characteristic for the subsequent myogenic differentiation stages. Based on the in vitro results I choose one hydrogel, i.e., R4-IL4-Y, which had the most beneficial impact on the cells. Transplantation of indicated hydrogel, alone or containing MBs-iPSCs into injured mouse muscle, supported muscle regeneration by increasing the expression of genes associated with myogenesis, angiogenesis, and neuromuscular junction formation. The obtained results suggest that the tested hydrogels may be potentially implemented in clinical practice.