Modyfikowane nukleotydy jako narzędzia do badania białek zaangażowanych w metabolizm końca 5’ mRNA

Informacyjne (lub matrycowe) RNA (mRNA; ang. messenger RNA), jest cząsteczką odpowiedzialną za przenoszenie informacji genetycznej z jądra komórkowego do cytoplazmy, co umożliwia biosyntezę białek. Informacją zakodowaną w mRNA jest sekwencja aminokwasów budujących funkcjonalne białko, które jest biosyntezowane w procesie translacji. Na końcu 5’ eukariotycznego mRNA znajduje się struktura zwana czapeczką (kapem). Jest to zazwyczaj dodatnio naładowana 7-metyloguanozyna (m7G) połączona z pierwszym transkrybowanym nukleotydem mostkiem 5’,5’-trifosforanowym (m7GpppN1pN2 ). Kap bierze udział w wielu ważnych procesach biologicznych zachodzących w komórkach eukariotycznych, takich jak dojrzewanie czy transport mRNA. Element ten chroni również mRNA przed przedwczesną degradacją przez 5’-egzonukelazy, reguluje proces translacji mRNA, a także odgrywa kluczową rolę w rozpoznawaniu komórkowego i obcego mRNA przez układ immunologiczny. Z powodu tak istotnych funkcji, struktura kapu oraz jego pochodne stały się bardzo interesującym obiektem chemicznych modyfikacji. Chemiczne modyfikowane analogi kapu i jego pochodne są obecnie wykorzystywane do monitorowania procesów komórkowych związanych z mRNA, jako narzędzia molekularne do badania białek rozpoznających strukturę kapu, jako reagenty do produkcji szczepionek mRNA, a także mają wiele innych potencjalnych zastosowań terapeutycznych, m.in. w terapiach przeciwnowotworowych. Głównym celem niniejszej rozprawy doktorskiej była synteza nowych, chemicznie modyfikowanych analogów nukleotydów, w tym analogów kapu, które mogłyby umożliwić badania wybranych procesów związanych z metabolizmem końca 5’ mRNA. Swoją uwagę skupiłem na analogach kapu i jego pochodnych, które można wykorzystać do badania procesu translacji mRNA oraz degradacji metabolitów jego końca 5’. W pierwszej części niniejszej rozprawy wykorzystałem analogi 5’-monofosforanu 7- metyloguanozyny (m7GMP) do badania roli ludzkiej cytozolowej 5’-nukleotydazy IIIB (cN-IIIB). Cytozolowa 5’-nukleotydaza IIIB (cN-IIIB), jest stosunkowo niedawno odkrytym enzymem należącym do rodziny 5’-nukleotydaz. Rolą 5’-nukleotydaz jest kontrolowanie stężeń 5’- monofosforanów nukleozydów (NMP) w komórkach poprzez katalizowanie ich defosforylacji. Enzym cN-IIIB jest unikalną 5’-nukleotydazą z punktu widzenia specyficzności substratowej, ponieważ katalizuje on reakcję defosforylacji 5’-monofosforanu 7-metyloguanozyny, który jest jednym z metabolitów końca 5’ mRNA. Do tej pory, rola enzymu cN-IIIB nie została w pełni poznana, jednak jego specyficzność substratowa sugeruje, że może on odgrywać kluczową rolę w jednym z końcowych etapów degradacji końca 5’ mRNA. Nie wykluczony jest także udział enzymu cN-IIIB w dezaktywacji aktywnych form terapeutyków pochodzenia nukleozydowego. W części rozprawy dotyczącej enzymu cN-IIIB, skupiłem się na poszukiwaniu inhibitorów enzymu cN-IIIB, które mogą pełnić rolę narzędzi molekularnych i być wykorzystane w badaniach nakierowanych na pogłębienie wiedzy o tym enzymie. Projekt ten obejmował zarówno syntezę modyfikowanych nukleotydów, a także zbadanie ich właściwości substratowych i inhibitorowych względem enzymu cN-IIIB. Na podstawie przeprowadzonych przeze mnie badań, spośród kilkudziesięciu związków wytypowałem dwie pochodne m7GMP jako najsilniejsze inhibitory enzymu cN-IIIB. Wyselekcjonowane związki zostały zastosowane jako narzędzia w badaniach w lizatach komórkowych, co miało na celu weryfikację roli enzymu cN-IIIB w degradacji metabolitów struktury kapu. Najsilniejsze inhibitory enzymu cN-IIIB zostały również wykorzystane do badań strukturalnych, dzięki którym otrzymano pierwszą strukturę krystalograficzną ludzkiego enzymu cN-IIIB wraz z ligandem. Wyselekcjonowane inhibitory enzymu cN-IIIB przekształciłem również w pronukleotydy, które mogą przenikać przez błonę komórkową do wnętrza komórki, i mogą być wykorzystane w badaniach in vivo. Na koniec, zbadałem właściwości inhibitorowe nowej klasy związków posiadających modyfikację umożliwiającą, w odpowiednich warunkach, samoistne wytworzenie wiązania kowalencyjnego z białkiem. Związki te zbadałem pod kątem ich właściwości inhibitorowych względem enzymu cN-IIIB. Z puli przebadanych związków udało mi się zidentyfikować związek będący kowalencyjnym, nanomolarnym inhibitorem enzymu cN-IIIB. Druga część niniejszej rozprawy doktorskiej dotyczyła badania procesu kap-zależnej translacji (ang. cap-dependent translation) mRNA, w który to zaangażowane jest białko eIF4E. Trinukleotydowe analogi kapu są wykorzystywane w reakcji transkrypcji in vitro do otrzymywania funkcjonalnego mRNA, w tym mRNA stosowanego w terapiach przeciwnowotworowych i przeciwwirusowych. Niestety, synteza trinukleotydowych analogów kapu jest trudna i czasochłonna. Z tego powodu w moim projekcie doktorskim, opisanym w drugiej części niniejszej rozprawy, zajmowałem się opracowaniem nowej ścieżki syntezy trinukleotydowych analogów kapu. Zaprojektowana przeze mnie ścieżka syntetyczna wykorzystywała chemię typu „click”, która miała na celu przyspieszenie i uproszczenie syntezy tri- i tetranukleotydowych analogów kapu, a dodatkowo wprowadzała w obrębie struktury kapu modyfikacje mające na celu potencjalne ulepszenie właściwości translacyjnych mRNA. Opracowana przeze mnie ścieżka syntetyczna skróciła czas ostatniego etapu syntezy trinukleotydowych analogów kapu do 1 h, podczas gdy synteza w standardowych warunkach może trwać nawet 48 h. Za pomocą opracowanej przeze mnie ścieżki syntetycznej, otrzymałem kilkanaście nowych analogów kapu, które posłużyły mi do badań kap-zależnej translacji mRNA. Otrzymane związki miały wydajnie wbudowywać się ko-transkrypcyjnie do nici mRNA oraz inicjować translację takiego mRNA wydajniej niż mRNA zakończone naturalnie występującym kapem. W wyniku reakcji transkrypcji in vitro otrzymałem mRNA zakończone różnymi analogami kapu, które następnie wykorzystałem do badania translacji w lizatach komórkowych. Tak przygotowane mRNA zostało również wykorzystane do zbadania wydajności procesu produkcji białka w komórkach dendrytycznych. Jeden z otrzymanych analogów kapu, okazał się być dobrym mimetykiem naturalnego kapu, gdyż wydajność translacji mRNA zakończonego modyfikowanym trinukleotydem była porównywalna z mRNA zakończona niemodyfikowanym kapem 1. Niniejszej rozprawa doktorska miał charakter interdyscyplinarny, w ramach której zajmowałem się zarówno syntezą chemiczną pochodnych końca 5’ mRNA jak i ich charakterystyką za pomocą testów biofizyczno-biochemicznych i biologicznych. Przeprowadzone przeze mnie badania przyczyniły się do uzyskania pierwszej struktury krystalograficznej ludzkiego enzymu cN-IIIB, dzięki której poznany został mechanizm działania tego enzymu. Z kolei zaprojektowany i zsyntezowany przeze mnie trinukleotydowy analog kapu, może być wykorzystany do syntezy mRNA o bardzo dobrych właściwościach translacyjnych, co potencjalnie może mieć zastosowanie w terapeutycznym mRNA.

Messenger RNA (mRNA) is the biomolecule responsible for carrying genetic information from the cell nucleus to the cytoplasm, which enables protein biosynthesis. The information encoded in mRNA is the sequence of amino acids that build a functional protein. The process of protein biosynthesis on the template of mRNA is called translation. At the 5’ end of eukaryotic mRNA is a structure called a cap. Cap, typically, is a positively charged 7- methylguanosine (m7G) linked to the first transcribed nucleotide by a 5’,5’-triphophate bridge (m7GpppN1pN2). Cap is involved in many important biological processes in eukaryotic cells, such as mRNA maturation and transport. The cap also protects mRNA from premature degradation by 5’-exonucleases, regulates mRNA translation, and plays a key role in the distinguishing of cellular and foreign mRNA by the immune system. Because of such important functions, the structure of the cap and its derivatives has become a very interesting target for chemical modifications. Chemically modified analogs of cap and its derivatives are currently used to monitor mRNA-related cellular processes, as molecular tools to study proteins that recognize cap structure, as reagents to produce mRNA vaccines, and have many other potential therapeutic applications, including anti-cancer therapies. The main goal of my PhD thesis was to synthesize new chemically modified nucleotide analogs, including cap analogs, which could be used for studying selected processes related to the metabolism of the 5’ end of mRNA. During my Ph.D. project, I focused on the synthesis of cap analogs and their derivatives, which can be used to study the process of mRNA translation and the degradation of its 5’ end metabolites. In the first part of my thesis, I used analogs of 7-methylguanosine 5'-monophosphate (m7GMP) to study the role of human cytosolic 5'-nucleotidase IIIB (cN-IIIB). Cytosolic 5'- nucleotidase IIIB (cN-IIIB), is a relatively recently discovered enzyme belonging to the 5'- nucleotidase family. The role of 5'-nucleotidases is to control the concentrations of nucleoside 5'-monophosphates (NMPs) in cells by catalyzing their dephosphorylation. The cN-IIIB enzyme is a unique 5'-nucleotidase because of its substrate specificity, as it catalyzes the reaction of dephosphorylation of 7-methylguanosine 5'-monophosphate, which is one of the metabolites of mRNA 5' end. To this day, the role of the cN-IIIB enzyme is not fully understood, but its substrate preferences suggest that it may play a key role in one of the final steps of 5' end mRNA degradation. The cN-IIIB enzyme may also be involved in the inactivation of active forms of nucleoside-derived therapeutics. In the first part of my thesis, I was looking for inhibitors of the cN-IIIB enzyme that can act as molecular tools and be used in studies that could further the knowledge of this enzyme. This project involved both the synthesis of modified nucleotides and the investigation of their substrate and inhibitory properties towards the cN-IIIB enzyme. Based on my research, I selected two m7GMP derivatives out of dozens of compounds as the most potent inhibitors of the cN-IIIB enzyme. The selected compounds were used as tools in studies in cell lysates to verify the role of the cN-IIIB enzyme in the degradation of cap structure metabolites. The most potent inhibitors of the cN-IIIB enzyme were also used for structural studies, which yielded the first crystallographic structure of the human cN-IIIB enzyme together with a ligand. I also transformed the selected cN-IIIB enzyme inhibitors into pronucleotides, which can get into the cell interior by crossing the cell membrane and can be used for in vivo studies. Finally, I investigated the inhibitory properties of a new class of compounds possessing a modification that allows, under the right conditions, the spontaneous formation of a covalent bond with a protein. I tested these compounds for their inhibitory properties against the cN-IIIB enzyme. From the pool of tested compounds, I was able to identify a compound that is a covalent nanomolar inhibitor of the cN-IIIB enzyme. The studies in the second part of my PhD thesis investigated the cap-dependent translation process of mRNA, in which the eIF4E protein is involved. Trinucleotide analogs of cap are used in an in vitro transcription (IVT) reaction to obtain functional mRNA, including mRNA used in anticancer and antiviral therapies. Unfortunately, the synthesis of trinucleotide analogs of cap is difficult and time-consuming. For this reason, in my PhD project, described in the second part of this thesis, I was developing a new pathway for the synthesis of trinucleotide cap analogs. The synthetic pathway I designed used click chemistry to accelerate and simplify the synthesis of tri- and tetranucleotide cap analogs, and additionally introduced modifications within the cap structure to potentially improve the translational properties of mRNA. The synthetic pathway I developed reduced the time for the final step of trinucleotide cap analogs synthesis to 1 h, whereas the synthesis under standard conditions can take up to 48 h. Using the developed synthetic pathway, I obtained more than a dozen new cap analogs, which I used to study cap-dependent mRNA translation. The obtained compounds were expected to efficiently co-transcriptionally incorporate into mRNA strands and to initiate translation of such mRNA more efficiently than mRNAs terminated with naturally occurring caps. The in vitro transcription reaction yielded mRNAs terminated with various cap analogs, which I then used to study translation in cell lysates. The mRNA prepared in this way was also used to study the efficiency of the protein production process in dendritic cells. One of the obtained cap analogs, turned out to be a good mimetic of natural cap, as the translation efficiency of mRNA terminated with the modified trinucleotide was comparable to mRNA terminated with unmodified cap 1. My Ph.D. project was interdisciplinary in nature, in which I was engaged in both the chemical synthesis of derivatives of the 5' end of mRNA and their characterization by biophysical, biochemical, and biological assays. My research contributed to the first crystallographic structure of the human cN-IIIB enzyme, through which the mechanism of action of the enzyme was understood. In turn, the trinucleotide cap analogs, designed and synthesized by me, can be used to synthesize mRNA with very good translational properties, which potentially have applications in therapeutic mRNA field.