Syntetyczne analogi trimetyloguanozyno kapu modyfikowane w mostku trifosforanowym jako narzędzia do badania snurportyny i optymalizacji sygnału transportu dojądrowego dla czynników terapeutycznych

Trimetyloguanozyno (TMG) kap wystepuje na 5’ koncu małych jadrowych RNA (sn RNA) u organizmów wyzszych. Jego główna funkcja jest transport małych jadrowych rybonukleoprotein (snRNP) do jadra komórkowego poprzez oddziaływanie z białkiem adaptorowym – snurportyna1. Struktura TMG kapu zbudowana jest z N2,N2,N7-trimetyloguanozyny połaczonej mostkiem 5’,5’-trifosforanowym z pierwszym nukleozydem łancucha RNA. Głównym celem badan zawartych w niniejszej rozprawie doktorskiej, było opracowanie metod syntezy chemicznej analogów kapu, posiadajacych rózne modyfikacje w obrebie mostka 5’,5’- trifosforanowego oraz zbadanie jak dana modyfikacja wpływa na ich własciwosci biologiczne – oddziaływanie ze snurportyna oraz odpornosc na degradacje enzymatyczna. Wazne jest takze, by wprowadzona modyfikacja nie zaburzała funkcjonowania kapu. Analogi o zwiekszonym badz porównywalnym powinowactwie do snurportyny, odporne na degradacje enzymatyczna (o przedłuzonym czasie zycia in vivo, w systemach biologicznych) stanowia potencjalne narzedzie do wprodzania terapeutyków do jadra komórkowego. Ponadto zarówno analogi modyfikowane w mostku fosforanowym, jak i znakowane fluorescencyjnie, mozna takze wykorzystac do badan nad mechanizmem procesów, w które zaangazowany jest TMG kap: transport dojadrowy makromolekuł, biosynteza TMG kapu, powstawanie agregatów snRNA w chorobie Alzheimera. Niniejsza rozprawa podzielona została na trzy główne czesci: Wstep Literaturowy, Badania Własne i Dyskusje Wyników oraz Czesc Eksperymentalna. We Wstepie Literaturowym czytelnik zostaje szczegółowo wprowadzony w role jaka odgrywa struktura TMG kapu w organizmach zywych: gdzie wystepuje, w jaki sposób powstaje, z jakimi białkami oddziałuje oraz na jakiej drodze zostaje zdegradowana. Omówione w tej czesci zostały takze własciwosci fizykochemiczne struktury TMG kapu. Przedstawiono równiez liczne przykłady syntez zarówno TMG kapu, jak i przykładowe sposoby wprowadzania modyfikacji mostka fosforanowego do struktury dinukleotydów. Koncowe rozdziały wprowadzaja czytelnika w zagadnienia zwiazane z absorpcja oraz fluorescencja struktury TMG kapu oraz białek, co jest bardzo przydatne do zrozumienia metod oraz wyników badan opisanych w dalszych rozdziałach. W czesci Badania Własne i Dyskusja Wyników w pierwszej kolejnosci przedstawiono cele pracy, nastepnie przedstawiona została synteza chemiczna analogów TMG kapu modyfikowanych w mostku 5’,5’-trifosforanowym, oraz znakowanych fluorescencyjnie. Przedstawiona została takze charakterystyka własciwosci spektroskopowych zsyntezowanych analogów. Nastepnie opisane zostały wyniki badan biofizycznych majacych na celu wyznaczenie powinowactwa analogów TMG kapu do snurportyny. W tej czesci zostały takze opisane wyniki badan biologicznych nad stabilnoscia zsyntezowanych analogów TMG kapu w warunkach in vitro, które nie były wykonane przez autorke. Wyniki te ukazuja jednak zasadnosc załozen niniejszej pracy oraz podjetych syntez chemicznych. I jednoczesnie ukazuja potencjał zsyntezowanych zwiazków. Wtrzeciej czesci – Czesci Eksperymentalnej- przedstawiony został szczegółowy opis wykonywanych eksperymentów. Poczawszy od syntez chemicznych oraz charakterystyki otrzymanych zwiazków (MS i NMR), poprzez opis metody biofizycznych, termodynamicznych, a skonczywszy na wyprowadzeniach wzorów, które niezbedne były w otrzymaniu niektórych wyników (wymienic jakich). Syntezy chemiczne oraz wyniki badan biofizycznych i biologicznych zostały opisane w czterech publikacjach naukowych, z czego dwóch z listy filadelfijskiej, a dwóch konferencyjnych. Piata publikacja jest w trakcie przygotowywania. Spis publikacji przedstawiono ponizej. Publikacje naukowe w czasopismach z listy filadelfijskiej: 1) Zytek M., Kowalska J., Lukaszewicz M., Wojtczak B. A., Zuberek A., Ferenc-Mrozek A., Darzynkiewicz E., Niedzwiecka A., Jemielity J., Towards novel efficient and stable nuclear import signals: synthesis and properties of trimethylguanosine cap analogs modified within the 5’,5’-triphosphate bridge, Org. Biomol. Chem., 2014, 12, 9184-9199. 2) Honcharenko M., Zytek M., Bestas B., Moreno P., Jemielity J., Darzynkiewicz E., Smith E. C. I., Stromberg R., Synthesis and evaluation of stability of m3 G-CAP analogues in serum-supplemented medium and cytosolic extract, Bioorganic Medicinal Chemistry, 2013, 21, 7921-7928. Publikacje konferencyjne: 1) Zytek M., Kowalska J., Darzynkiewicz E., Jemielity J., The First Examples of Phosphate Modified Trimethylguanosine Cap Analogues, Coll. Symp Ser, 2011, 12, 503-504. 2) Zytek M., Kowalska J., Lukaszewicz M., Darzynkiewicz E., Niedzwiecka A., Jemielity J., Evaluation of biological activity of trimethylguanosine cap analogs modified within the 5’,5’-triphosphate bridge, Coll. Symp Ser, 2014, 14, 416-417.