Charakterystyka intronów niekonwencjonalnych u euglenin (Euglenida)

Eugleniny (Euglenozoa, Discoba) to kosmopolityczne jednokomórkowe organizmy wodne. W ich genomach jądrowych, w genach kodujących białka, występują dwa typy intronów: konwencjonalne i niekonwencjonalne. Pierwsze z nich posiadają kanoniczne sekwencje złączy, zgodne z regułą GT/C-AG. Introny te są wycinane z dojrzewającego pre-mRNA za sprawą spliceosomu, a uwolnione przyjmują konformację lassa. Drugi rodzaj intronów cechuje się zmiennymi złączami oraz zdolnością do przyjmowania stabilnej struktury drugorzędowej. Introny niekonwencjonalne są znane nauce od lat 90. XX w., mimo to wiedza na ich temat długo pozostawała szczątkowa. Praca stanowi pierwszą tak obszerną charakterystykę intronów niekonwencjonalnych euglenin. Dowiedziono, że wycięte introny niekonwencjonalne przyjmują formę kowalencyjnie zamkniętych, kolistych cząsteczek RNA o pełnej długości sekwencji – w ramach pracy odkryto nowy typ kolistych intronowych RNA u Eukarya. Potwierdzono też, że konwencjonalne introny klejnotek są usuwane jako lassa. Ustalono również względną oraz rzeczywistą kolejność uwalniania intronów z transkryptów genów zawierających introny obu typów. Wykazano też, że introny konwencjonalne są wycinane przed intronami niekonwencjonalnymi oraz że konwencjonalny splicing in trans może zachodzić przed niekonwencjonalnym splicingiem in cis. Tym samym podważono dotychczasowe błędne hipotezy zawarte we wcześniejszych doniesieniach. W ramach przeprowadzonych badań opracowano oraz wstępnie przetestowano metodę analizy uwolnionych intronów i innych typów kolistych RNA klejnotek w skali całego genomu, z użyciem specjalnie zaprojektowanego zestawu do deplecji rRNA, trawieniem RNazą R, zastosowaniem wielokrotnej amplifikacji przemieszczeniowej oraz sekwencjonowania trzeciej generacji. Strategia eksperymentalna zaproponowana w tej pracy może być wykorzystana nie tylko w odniesieniu do euglenin, ale też wobec innych organizmów o nietypowej organizacji RNA, dla których nie istnieją gotowe, komercyjne rozwiązania. W pracy wykazano też, że pladienolid B – substancja blokująca działanie spliceosomu u wielu organizmów eukariotycznych, nie zakłóca aktywności spliceosomu klejnotek. Wobec tego kwestia potencjalnego udziału spliceosomu w uwalnianiu intronów niekonwencjonalnych pozostaje otwartym problemem. Niemniej ustalenia zawarte w niniejszej pracy w znaczący sposób wzbogacają stan wiedzy na temat intronów niekonwencjonalnych euglenin. Otwierają tym samym pole do podjęcia dalszych badań.

Euglenids (Euglenozoa, Discobids) are cosmopolitan, single-celled phytoflagellates. Their nuclear protein-coding genes harbor two major types of introns: conventional and nonconventional. Conventional introns have canonical GT/C-AG borders and are removed from pre-mRNAs by spliceosome as lariats. Meanwhile, nonconventional introns do not follow GT/C-AG rule. They can adopt a slightly conserved secondary structure, which brings together intron ends – presumably playing a role in their removal. Nonconventional introns have been known to science since the 90s, although they remained understudied. Herein, the first such extensive characteristics of nonconventional introns is provided. It was proved that released nonconventional introns adopt the physical form of covalently closed full-length intronic circular RNA molecules. Thus, in this work, a novel type of intron-derived circular RNA in Eukarya has been discovered. In addition, it was confirmed that conventional spliceosomal introns of euglenids are removed as lariats. Furthermore, the relative and actual order of intron removal from gene transcripts containing both types of introns was also investigated. It was demonstrated that conventional introns are excised before nonconventional ones. Moreover, it was shown that conventional trans-splicing can occur before nonconventional cis-splicing. Thus, the incorrect hypotheses presented in earlier reports were questioned. As important part of the research, an experimental protocol of high-throughput analysis of released introns and other circular RNAs of euglenids was developed and initially tested. The proposed methodology utilized a specially designed set of rRNA depletion probes, RNase R digestion, multiple displacement amplification and a third generation sequencing. This experimental strategy can be used not only in case of euglenids, but also be applied for other, especially non-model organisms with atypical RNA organization. The study also showed that pladienolide B - a well-known spliceosome inhibitor, does not affect the activity of the spliceosome in euglenids. Therefore, whether the spliceosome participates in the removal of nonconventional introns or whether this process takes place regardless of the spliceosome remains open. Nevertheless, the findings contained in this thesis significantly enrich the knowledge about nonconventional introns in euglenids. Thus, findings presented herein open the field for further, even more detailed research.