Unraveling the mechanism that introduces disulfide bonds in Campylobacter jejuni – interactions between Dsb proteins

Według danych Światowej Organizacji Zdrowia (ang. World Health Organization, WHO) bakterie z rodzaju Campylobacter są jednym z czterech głównych czynników odpowiedzialnych za występowanie biegunek wśród ludzi. Raporty Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (ang. European Food Safety Authority, EFSA) dokumentują że w Europie kampylobakterioza to najczęściej występująca choroba odzwierzęca od 2005 roku. Kilka gatunków rodzaju Campylobacter jest zdolnych do infekcji ludzi, jednak za największą liczbę przypadków chorobowych odpowiedzialny jest Campylobacter jejuni. Infekcje C. jejuni najczęściej powodują biegunki, bóle brzucha, nudności, gorączkę a czasem także wymioty. Większość zakażeń trwa około tygodnia i nie wymaga interwencji lekarskich. Część zakażeń może prowadzić do rozwoju poważnych ogólnoustrojowych chorób takich jak np. zespół Guillaina-Barrégo (GBS), zespół Millera Fishera (MFS), reaktywne zapalenie stawów a także zespół jelita drażliwego (IBS). C. jejuni to mikroaerofilna gramujemna pałeczka, która bytuje głównie w przewodzie pokarmowym drobiu – jest to główny rezerwuar zakażeń. W przeciwieństwie do innych bakterii enteropatogennych, C. jejuni nie posiada klasycznych czynników wirulencji, takich jak np. enterotoksyny. Patogen ten wykształcił szereg innych mechanizmów, które umożliwiają mu kolonizację jelit oraz przetrwanie w komórkach gospodarza. Wśród nich do najważniejszych można zaliczyć a) obecność rzęsek, które umożliwiają ruch oraz są zaangażowane w procesy adhezji i inwazji do komórek, b) zdolność do chemotaksji, c) produkcję otoczki polisacharydowej i lipooligosacharydu na powierzchni komórki a także d) adaptacje metaboliczne, umożliwiające wykorzystanie różnych źródeł węgla, oraz e) rozbudowane szlaki oddechowe. Globalny, narastający problem antybiotykooporności wśród bakterii, w tym Campylobacter, zmusza nas do poszukiwania nowych przeciwbakteryjnych leków, które mają na celu blokowanie procesów wirulencji. Jako jeden z celów dla tych terapeutyków typowane są białka odpowiedzialne za wprowadzanie mostków disiarczkowych – białka Dsb. Wpływ tej grupy białek na wirulencję został do tej pory udokumentowany m.in. w przypadku takich bakterii jak Salmonella enterica sv. Typhimurium, Helicobacter pylori, Francisella tularensis, Bordetella pseudomallei, Campylobacter jejuni. Białka Dsb są zaangażowane w potranslacyjną modyfikację białek. Ich mechanizm działania najdokładniej został opisany dla modelowego szczepu Escherichia coli K-12. System Dsb działa w dwóch szlakach – utleniania (białko EcDsbA wprowadza mostki disiarczkowe, natomiast EcDsbB odpowiada za jego ponowne utlenianie) oraz izomeryzacji-redukcji (EcDsbC rearanżuje błędnie wprowadzone mostki, EcDsbG pełni rolę białka opiekuńczego, EcDsbD jest partnerem redoks obu białek przywracając ich formę zredukowaną). Cechą charakterystyczną białek Dsb jest obecność domeny tioredoksynowej (TRX), motywu katalitycznego CXXC oraz motywu pętli cis-prolinowej. W komórkach niektórych uropatogennych szczepów E. coli występuje dodatkowa para tiolowych oksydoreduktaz o aktywności utleniającej (EcDsbL-EcDsbI) i wąskiej specyficzności. Ich substratem jest sulfotransferaza arylosiarczanowa (ASST). Coraz więcej dostępnych badań dokumentuje, że system działający w komórkach E. coli K-12 nie jest uniwersalny dla wszystkich bakterii, a szlaki wprowadzania mostków disiarczkowych są bardzo zróżnicowane w komórkach mikroorganizmów. Prowadzone dotąd badania pokazały, że w działanie szlaku oksydacyjnego systemu Dsb C. jejuni 81116 zaangażowane są cztery białka – dwie oksydazy CjDsbA1 oraz CjDsbA2, oraz dwa błonowe białka CjDsbB oraz CjDsbI (różne od EcDsbI). Analizy filogenetyczne wskazują, że oba CjDsbA są bliżej spokrewnione z białkiem EcDsbL niż EcDsbA. CjDsbA2-CjDsbB tworzą funkcjonalną parę odpowiadającą EcDsbL-EcDsbI, a substratem CjDsbA2 jest CjAstA (arylosulfotransferaza). CjDsbA1 to główne białko szlaku utleniania. CjDsbB opowiada za ponowne utlenianie zarówno CjDsbA1 jak i CjDsbA2. Rola białka CjDsbI w komórkach nie została wyjaśniona. Jest to nietypowy homolog białek DsbB, który oprócz N-końcowej błonowej domeny (charakterystycznej dla białek DsbB), posiada także peryplazmatyczną C-końcową domenę o strukturze β-śmigła, potencjalnie odpowiadającą za interakcje z innymi białkami. Jej rola pozostaje nieznana. Funkcjonowanie szlaku izomeryzacji-redukcji nie było jak dotąd przedmiotem badań. W analizach in silico zidentyfikowano dwa białka będące potencjalnymi składnikami tego szlaku – C8J_1298 (homolog DsbC) oraz C8J_0565 (homolog DsbD). Prezentowana rozprawa doktorska miała na celu dalszą analizę funkcjonowania systemu Dsb w komórkach C. jejuni 81116, zbadanie interakcji pomiędzy białkami systemu oraz określenie wpływu białek Dsb na wirulencję oraz fizjologię komórki. Pierwsza część badań skupiała się na charakterystyce i poznaniu roli białka C8J_1298 w komórkach C. jejuni 81116. Analiza filogenetyczna wykazała, że białko to zalicza się do grupy białek DsbC/DsbG-podobnych z rodzajów Campylobacter i Helicobacter oraz wskazała na jego pokrewieństwo z Hp0231 (DsbK) H. pylori. Dimeryczne białko DsbK pełni rolę oksydazy systemu Dsb w komórkach H. pylori. W przeciwieństwie do DsbK, które posiada motyw katalityczny charakterystyczny dla białek DsbA, C8J_1298 posiada motyw katalityczny taki jak białko EcDsbG. Już na tym etapie badań zebrane informacje wskazywały na nietypowy charakter C8J_1298 i możliwość jego zaangażowania zarówno w procesy izomeryzacji/redukcji (motyw katalityczny) jak i oksydacji (podobieństwo do DsbK). Odpowiedzi na postawione pytanie szukano przy wykorzystaniu metod biochemicznych (testy przeprowadzone na oczyszczonym białku) oraz analizując aktywność C8J_1298 w komórkach typu dzikiego czy odpowiednich mutantów. Oba cykle badań potwierdziły hipotezę o podwójnej aktywności C8J_1298. Podstawowy w badaniach oksydoreduktaz test biochemiczny (zdolność do redukcji insuliny w obecności DTT) potwierdził przynależność C8J_1298 do grupy tiolowych oksydoreduktaz. Z wykorzystaniem zredukowanej lub niepoprawnie zwiniętej RNazyA udowodniono jego właściwości utleniające i izomeryzacyjne. Aktywność badanego białka we wszystkich trzech testach była porównywalna do tej charakterystycznej dla EcDsbC, co wskazywało na jego aktywność redukującą. Analiza potencjału redoks C8J_1298 nie dała jednoznacznej odpowiedzi i wskazała raczej na jego utleniające właściwości. Wartość potencjału redoks wynosiła -121 mV i była wyższa od tej prezentowanej przez EcDsbC (-147 mV), porównywalna z wartością potencjału redoks EcDsbA (-122 mV) czy EcDsbG (-127 mV). Zidentyfikowanie w sekwencji aminokwasowej białka N-końcowej domeny dimeryzacyjnej oraz przeprowadzenie reakcji sieciowania z wykorzystaniem glutaraldehydu pokazało zdolność białka do tworzenia form oligomerycznych, wskazując że występuje ono w formie dimeru. Również analizy funkcjonalne w komórkach C. jejuni 81116 (szczep dziki i szczepy zmutowane w genach dsb) oraz E. coli wykazały, że C8J_1298 jest białkiem bifunkcyjnym. W komórkach C. jejuni, C8J_1298 występowało w dwóch formach – utlenionej i zredukowanej (z przewagą tej drugiej). Udowodniono, że jego partnerem redoks odpowiadającym za powrót do zredukowanej formy jest CjDsbD (C8J_0565) oraz że brak innych elementów szlaku utleniania (CjDsbA1, CjDsbB, CjDsbI) wpływał na stan redoks C8J_1298. Najciekawsze okazały się wyniki analiz funkcjonalnych w komórkach podwójnych mutantów C. jejuni, które udokumentowały, że C8J_1298 oraz CjDsbA1 mogą się zastępować w szlaku utleniania. Tylko komórki nie produkujące obu tych białek wykazywały podwyższoną wrażliwość na jony kadmu oraz DTT (cecha szczepów defektywnych we wprowadzaniu mostków disiarczkowych). Aktywność C8J_1298 w szlaku izomeryzacji-redukcji, zbadana w teście wrażliwości na jony miedzi (II), wskazała na marginalną rolę tego białka w tym procesie. Ciekawy okazał się fakt, że CjDsbD (partner redoks C8J_1298), w przeciwieństwie do C8J_1298, jest zaangażowane w ochronę komórek przed toksycznym działaniem jonów miedzi (II). Wskazuje to, że prawdopodobnie oddziałuje z innym niezidentyfikowanym dotąd białkiem. Udowodniono, że oba białka C8J_1298 oraz CjDsbD uczestniczą w ochronie komórek przed stresem oksydacyjnym, generowanym przez H2O2. Także w komórkach heterologicznego gospodarza E. coli białko C8J_1298 może działać zarówno w szlaku utleniania jak i szlaku izomeryzacji-redukcji. Kolejny etap badań skupiał się na analizie dwóch monomerycznych oksydaz CjDsbA1 oraz CjDsbA2. Działanie tych dwóch białek zostało wcześniej częściowo zbadane i opisane przez dr Annę Grabowską. Kolejne analizy pokazały, że oba białka CjDsbA1 oraz CjDsbA2 prezentują właściwości biochemiczne charakterystyczne zarówno dla białka EcDsbL (brak aktywności w teście redukcji insuliny) jak i białka EcDsbA (zdolność do utleniania zredukowanej RNazyA). Potencjał redoks obu białek Campylobacter wskazuje na silnie utleniające właściwości, a potencjał CjDsbA1 jest najwyższy wśród przebadanych dotąd białek DsbA. Oba białka CjDsbA występują w komórce w stanie utlenionym, a ich stan redoks nie jest od siebie zależny. Białko CjDsbB oddziałuje z CjDsbA1 i CjDsbA2. Brak CjDsbB w komórce prowadził do ledwie wykrywalnego poziomu CjDsbA2 i występowania CjDsbA1 głównie w formie zredukowanej. Wyniki analizy podwójnych mutantów ΔcjdsbA1ΔcjdsbA2 potwierdziły, że to CjDsbA1 wraz z C8J_1298 odgrywa główną rolę we wprowadzaniu mostków disiarczkowych w komórkach C. jejuni 81116, a rola CjDsbA2 jest ograniczona. Obecność CjDsbA2 w komórce nie jest niezbędna (przynajmniej w testowanych warunkach). W komórkach E. coli defektywnych w szlaku utleniania systemu Dsb, tylko CjDsbA1 zastępowało brak białka EcDsbA w teście sprawdzającym wrażliwość na jony kadmu. Komplementacja była zależna od obecności EcDsbB. Rozwiązanie struktury obu CjDsbA wykazało relatywnie małe różnice pomiędzy nimi. Porównanie otrzymanych struktur ze znanymi strukturami EcDsbA i EcDsbL wykazało, że EcDsbA najbardziej różni się od trzech pozostałych białek. Porównanie struktury centrum aktywnego białek pochodzących z E. coli oraz C. jejuni pokazało różnice w ich budowie. Hydrofobowy charakter rowka oddziałującego z partnerem redoks, na powierzchni białka, został zachowany, jednak w przypadku białek CjDsbA1 i CjDsbA2 jego hydrofobowość wydaje się być słabsza. Aby sprawdzić, czy drobne różnice strukturalne występujące pomiędzy obiema oksydazami CjDsbA wpływają na oddziaływania z partnerem redoks – CjDsbB, przeprowadzono analizy in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych białek oraz egzogennego akceptora elektronów (menachinonu lub ubichinonu). Wyniki pokazały, że tempo utleniania zredukowanych CjDsbA1 i CjDsbA2 przez CjDsbB jest podobne dla obu białek. W ostatnim etapie prowadzonych badań zidentyfikowano substraty białek szlaku oksydacyjnego Dsb C. jejuni oraz zbadano wpływ białek C8J_1298 i CjDsbA1 na wirulencję. Porównanie subproteomów peryplazmatycznych szczepu dzikiego i podwójnego mutanta ΔcjdsbA1Δc8j_1298 pozwoliło na zidentyfikowanie białek podlegających modyfikacjom przez system Dsb. Wśród nich znalazły się białka, których analiza pozwoliła na przypisanie ich do kilku grup według bazy KEGG pathways, białek zaangażowanych a) w systemy transportu typu ABC, b) w szlaki oddechowe, c) w metabolizm aminokwasów, d) białek kodowanych przez geny konstytutywne (ang. housekeeping) oraz e) białek jak dotąd nieprzypisanych do żadnej z grup. Analizy przeprowadzone na modelu zwierzęcym, larwach Galleria mellonella, pokazały, że inaktywacja systemu Dsb (komórki defektywne w ekspresji genów cjdsbA1 i c8j_1298) obniża poziom śmiertelności larw zakażonych komórkami szczepu mutanta w porównaniu z larwami zainfekowanymi komórkami C. jejuni typu dzikiego. Podsumowując, zaprezentowane w niniejszej rozprawie wyniki badań pokazują, że system białek Dsb działający w komórkach C. jejuni 81116 jest złożony, a sposób funkcjonowania różni się od modelowego systemu opisanego w komórkach E. coli K-12. Porównanie uzyskanych wyników z danymi dotyczącymi innych mikroorganizmów udowadnia, że wykształcenie szlaków złożonych z większej liczby białek zaangażowanych we wprowadzanie mostków disiarczkowych w komórkach nie jest niczym niezwykłym. Prezentowane wyniki wskazują, że działanie w szlaku utleniania dwóch monomerycznych oksydaz (CjDsbA1 i CjDsbA2) oraz jednego bifunkcyjnego białka (C8J_1298) może być mechanizmem, który umożliwia komórkom C. jejuni 81116 jak najlepsze dostosowanie do warunków środowiska życia i przeprowadzanie efektywnych procesów wirulencji.

According to World Health Organization (WHO) bacteria belonging to the genus Campylobacter are one of the four major causative agents responsible for diarrhea among humans. European Food Safety Authority (EFSA) reports indicate that campylobacteriosis has been the most commonly reported zoonosis in Europe, since 2005. A few Campylobacter species are capable of infecting humans, however, Campylobacter jejuni is responsible for the greatest amount of reported cases. Clinical symptoms of C. jejuni infection can be watery or bloody diarrhea, abdominal pain, nausea, fever and sometimes vomiting. Although, C. jejuni infections are usually mild and self-limiting, in some cases can lead to systemic disorders, such as Guillain-Barré syndrome (GBS), Miller Fisher syndrome (MFS), reactive arthritis or inflammatory bowel syndrome (IBS). C. jejuni is a microaerophilic, gram-negative rod which mainly inhabits digestive tract of poultry. In contrast to other enteropathogenic bacteria, such as Escherichia coli or Salmonella enterica, C. jejuni genome does not encode classical virulence factors, like e.g. enterotoxins. C. jejuni possess a several mechanisms that enable the bacterium to invade and to survive inside the host epithelial cells. Among the most important factors we can mention: a) two bacterial flagella, which promote motility, adhesion and invasion process, b) a chemotaxis system, c) a polysaccharide capsule and a lipooligosaccharide on the cell surface, d) numerous metabolic adaptations, which enable the bacterium to use diverse metabolites as a carbon sources, and e) highly-branched respiratory chains. The growing antibiotic resistance among bacteria, including Campylobacter, has become a global threat in recent years. Therefore, the scientists put many efforts to develop new antibacterial agents to inhibit virulence processes. Dsb proteins – responsible for disulfide bond formation in bacterial periplasmic proteins, have been proposed as one of the targets for new antimicrobials. It has been proved that pathogenicity of some microorganisms, like S. enterica sv. Typhimurium, Helicobacter pylori, Francisella tularensis, Bordetella pseudomallei, C. jejuni depends on the functioning of the Dsb system. Dsb proteins are responsible for posttranslational protein modifications. The well-studied E. coli K-12 system encompasses of two pathways – oxidation pathway (EcDsbA protein acts as an oxidase and introduces disulfide bonds into newly synthetized proteins, EcDsbB is its redox partner, responsible for EcDsbA reoxidation) and isomerization-reduction pathway (EcDsbC rearranges incorrectly introduced disulfides, EcDsbG acts as a molecular chaperone and EcDsbD is redox partner of both EcDsbC and EcDsbG). The common feature presented by all the Dsb proteins is thioredoxin (TRX) fold in their structure, catalytic motif CXXC and cis-proline loop. In some uropathogenic E. coli strains (UPEC) additional redox pair EcDsbL and EcDsbI functions. These proteins are homologs to EcDsbA-EcDsbB proteins. ASST (arylsulfate sulfotransferase) is substrate protein of EcDsbL. There is growing number of evidence showing that E. coli Dsb system is non-canonical to all the microorganisms and many different Dsb pathways are functioning in cells of bacterial species. C. jejuni 81116 oxidative Dsb pathway consist of four proteins – two monomeric oxidases CjDsbA1 and CjDsbA2, and two membrane proteins CjDsbB and CjDsbI (different from EcDsbI). Phylogenetic analyses revealed that CjDsbA1 and CjDsbA2 are more closely related to EcDsbL, rather than to EcDsbA. It was proven that CjDsbA2-CjDsbB pair of proteins is a functional counterpart of EcDsbL-EcDsbI redox pair and CjAstA (arylsulfotransferase) is substrate of CjDsbA2. CjDsbA1 plays major role in C. jejuni oxidative pathway. CjDsbB protein interacts with both CjDsbA1 and CjDsbA2 proteins. CjDsbI is untypical DsbB homolog, which encompasses of two domains. N-terminal domain is membrane-anchored, and it is typical to DsbB proteins. The C-terminal domain is periplasmic and it folds into β-propeller structure, which can be engaged into proteins’ interactions, but its role still remains unknown. The function of CjDsbI in C. jejuni cells needs to be tested. Performing in silico analysis has led to identification of two proteins, probably involved in isomerization-reduction pathway in C. jejuni cells – C8J_1298 (EcDsbC homolog) and C8J_0565 (EcDsbD homolog). The aim of presented work was to gain further insight into functioning of Dsb system in C. jejuni 81116 cells by performing analyses which unravel interactions between Dsb proteins and by assessing their impact on pathogenicity and cell physiology. The first part of the work was focused on functional characteristic of C8J_1298 and gaining the understanding of its role in C. jejuni 81116 cells. Phylogenetic analysis has shown that C8J_1298 belongs to DsbC/DsbG-like proteins group, which functions in genera of Campylobacter and Helicobacter. C8J_1298 is closely related to H. pylori Hp0231 (DsbK). Dimeric DsbK protein plays oxidative role in H. pylori cells. In contrast to DsbK, which catalytic motif is typical for DsbA proteins, C8J_1298 CXXC and XP (in cis-proline loop) motifs are the same as in EcDsbG protein. Those analyses indicated untypical role of C8J_1298 protein and its possible involvement in isomerization-reduction pathway (catalytic motif) as well as in oxidative pathway (based on similarity to DsbK). The clarification of the issues were sought using biochemical methods (analyses carried out with purified protein) as well as by analyzing activity in wild-type cells or appropriate mutant cells. Both types of research confirmed the hypothesis of dual activity of C8J_1298. Biochemical characteristic of C8J_1298 protein proved that it belongs to thiol oxidoreductases family as it was active in insulin reduction assay. Using reduced or scrambled RNaseA oxidative and isomerizing activities of protein were demonstrated, respectively. In all three assays, the activity of C8J_1298 was comparable to that of EcDsbC, which suggested its reducing activity. Determined C8J_1298 redox potential suggested rather its oxidizing activity. It was -121 mV and was more oxidizing than that presented by EcDsbC (-147 mV). It was more related to redox potential of EcDsbA (-122 mV) or EcDsbG (-127 mV). Protein’s amino acid sequence analysis has led to identification of N-terminal dimerization domain in protein structure. To verify its functionality, crosslinking experiment using glutharaldehyde was performed, which indicated that C8J_1298 exists as a dimer. Analyses performed in C. jejuni 81116 and in E. coli cells also showed that C8J_1298 acts as a bifunctional protein. C8J_1298 existed mainly in the reduced form in wild type C. jejuni cells but oxidized form was also present. It was demonstrated that CjDsbD (C8J_0565) is redox partner of C8J_1298, which is responsible for its reduction. Other Dsb proteins (CjDsbA1, CjDsbB and CjDsbI) also had an influence on C8J_1298 redox state. Interesting results were shown, when double mutated C. jejuni cells were analyzed. That experiment documented the cooperation between C8J_1298 and CjDsbA1 in oxidative Dsb pathway of C. jejuni. Only cells lacking both CjDsbA1 and C8J_1298 demonstrated increased sensitivity to DTT or cadmium ions (it is characteristic feature of improper action of Dsb oxidative pathway). C8J_1298 protein activity in isomerization-reduction pathway, which was assessed in copper sensitivity assay, revealed its marginal role in that process. CjDsbD (C8J_1298 redox partner), in contrast to C8J_1298, played a leading role in copper resistance of C. jejuni cells, moreover it is likely to interact with some other(s), still unidentified protein(s). It was demonstrated that both proteins C8J_1298 and CjDsbD are engaged in resistance to oxidative stress generated by H2O2. Also, evaluation of activity of C8J_1298 in E. coli cells showed that it was able to act in oxidative as well as in isomerization-reduction pathway. The second part of presented work was concentrated on the analysis of activity of two monomeric oxidases CjDsbA1 and CjDsbA2. Their functionality was previously studied by dr Anna Grabowska. Presented thesis provides more detailed information. Performed biochemical analyses demonstrated that CjDsbA1 and CjDsbA2 exhibited features typical to both EcDsbL (inability to reduce insulin) and EcDsbA (oxidation of reduced RNaseA) proteins. Redox potential of both Campylobacter proteins indicated their highly oxidizing properties. CjDsbA1 presented the highest redox potential among so far analyzed DsbA proteins. Both CjDsbA proteins existed in oxidized form in C. jejuni cells. Neither of them affected the redox state of the other. CjDsbB protein interacts with both CjDsbA1 and CjDsbA2, furthermore the absence of CjDsbB led to the low quantity of CjDsbA2. Double mutated ΔcjdsbA1ΔcjdsbA2 strain analysis confirmed leading role of C8J_1298 and CjDsbA1 in oxidative folding of C. jejuni 81116 proteins. Based on performed analyses CjDsbA2 was shown to be dispensable protein and its role in bacterial cells could be limited to specific conditions. In E. coli cells, only CjDsbA1 protein was able to restore the lack of EcDsbA in cadmium sensitivity assay. The ability to complementation was EcDsbB dependent. Crystal structures of CjDsbA1 and CjDsbA2 were slightly different from each other. Comparison of both CjDsbAs with known structures of EcDsbA and EcDsbL demonstrated that EcDsbA was most different to all the three proteins. The active sites of E. coli and C. jejuni proteins demonstrated structural differences. Hydrophobic groove on DsbA surface is responsible for interactions with redox partner. Its hydrophobic character was maintained in Campylobacter proteins, although its hydrophobicity seemed to be weaker. To assess, whether small structural differences between CjDsbA1 and CjDsbA2 influence interactions with redox partner (CjDsbB), in vitro analyses with purified CjDsb proteins and menaquinone or ubiquinone as electron acceptors were performed. They revealed that the rate of reoxidation of both, reduced CjDsbA1 and CjDsbA2, by CjDsbB were similar. In the last part of this work, C. jejuni Dsb oxidative pathway substrates were identified and the influence of C8J_1298 and CjDsbA1 on bacterial virulence was determined. The comparison between periplasmic subproteomes of wild type strain and double mutated ΔcjdsbA1Δc8j_1298 strain enabled identification of Dsb system’s substrate proteins. Among recognized proteins, there were a few which could have been assigned according to KEGG pathways: a) ABC transporters, b) respiration related, c) amino acids metabolism, d) housekeeping and e) unknown. Obtained results indicated that Dsb proteins are important for C. jejuni virulence. It was demonstrated, using Galleria mellonella larvae model, that Dsb system inactivation (ΔcjdsbA1Δc8j_1298 mutated cells) increased larvae survival after C. jejuni infection when compared with wild type strain infection. In summary, herein presented results demonstrated the complexity of C. jejuni 81116 Dsb system. Its functioning is very different from the model system of E. coli K-12. Moreover, the comparison of obtained results to other available data, clearly proves that Dsb systems, where more than one DsbA-like protein functions seem not to be extraordinary. The results presented in this thesis indicate, that functioning in C. jejuni cells oxidative Dsb pathway with two monomeric oxidases (CjDsbA1 and CjDsbA2) and one bifunctional protein (C8J_1298) could be adaptation mechanism, which enables microorganism’s environmental fitness and effective pathogenicity toward host cells.