Charakterystyka funkcji i oddziaływań białek Dsb (disulfide bond formation) Helicobacter pylori

Wiązania disiarczkowe tworzone pomiędzy grupami tiolowymi cystein stabilizują strukturę trzecio- i czwartorzędową wielu białek pozacytoplazmatycznych przez co mogą od-grywać kluczową rolę w zwijaniu czynników wirulencji bakterii patogennych. Proces ten jest katalizowany przez białka należące do rodziny Dsb (ang. disulfide bond). W komórkach E. coli białka Dsb działają w dwóch szlakach metabolicznych: utleniania (DsbA, DsbB) i izomeryza-cji/redukcji (DsbC i DsbD). Liczba zsekwencjonowanych genomów stale wzrasta, a ich anali-zy ujawniają, że systemy Dsb funkcjonujące w komórkach różnych gatunkach mikroorgani-zmów są różnorodne i często odmienne od dokładnie scharakteryzowanego systemu Dsb funkcjonującego w komórkach modelowej bakteri - Escherichia coli. Obiektem badań prezentowanej rozprawy doktorskiej jest Helicobacter pylori mikroae-rofilna, gramujemna, spiralna bakteria, którą zakażone jest 50% ludzkiej populacji. Mikroorga-nizm jest czynnikiem etiologicznym stanów zapalnych, choroby wrzodowej i nowotworowej żołądka (adenocarcinoma) oraz choroby wrzodowej dwunastnicy. Infekcja tym patogenem uznawana jest także za czynnik ryzyka rozwoju raka MALT - tkanki limfatycznej powiązanej z błoną śluzową żołądka. Pomimo ponad dwudziestoletniego doświadczenia w terapii zakażeń H. pylori wciąż poszukuje się skuteczniejszych sposobów leczenia, ponieważ mimo stosowania nawet najefektywniejszych schematów terapeutycznych do 20% pacjentów pozostaje nie wy-leczona. Szlak wprowadzania wiązań disiarczkowych w komórkach H. pylori nie został do tej pory scharakteryzowany. Z analiz zsekwencjonowanych genomów kilku szczepów patogenu oraz badań wstępnych wykonanych w Zakładzie Genetyki UW wynikało, że mechanizm two-rzenia mostków disiarczkowych różni się od tego funkcjonującego zarówno w komórkach E. coli jak i w komórkach spokrewnionego gatunku Campylobacter jejuni. W proteomie H. pylori występuje rzadki homolog białka DsbB – DsbI, jednak brak w nim homologa głównej oksydo-reduktazy DsbA, co sugeruje, że inny enzym może pełnić jego funkcję. Analizy in silico ge-nomu H. pylori 26695 pozwoliły na identyfikację genów kodujących dwa dodatkowe białka posiadające charakterystyczny dla białek Dsb zwój tioredoksynowy z motywem katalitycz-nym CXXC. Są to hp0231 opisany jako gen kodujący przypuszczalnie homolog DsbG E. coli oraz hp0377 opisany jako gen kodujący przypuszczalnie homolog DsbC E. coli. Przedstawiona rozprawa doktorska jest próbą wyjaśnienia funkcjonowania szlaku wprowadzania wiązań disiarczkowych do białek pozacytoplazmatycznych H. pylori. Pierwsza jej część dotyczy funkcjonalnej charakterystyki białka HP0231. Wykazano, że jest ono dime-rem, posiadającym właściwości redukujące, które świadczą o jego przynależności do grupy oksydoreduktaz. Wysoki potencjał redoks oraz forma utleniona w jakiej HP0231 występuje w komórkach H. pylori dowodzi o pełnionej przez nie funkcji oksydazy. Mutant w genie hp0231 wykazuje, podobnie jak mutant E. coli dsbA, efekt plejotropowy. Charakteryzuje się podwyż-szoną wrażliwością na DTT, niezdolnością do ruchu oraz zmianą morfologii komórek. Dodat-kowo HP0231 komplementuje brak białka DsbA w komórkach mutanta genu dsbA E. coli. Eksperymenty wykonane z zastosowaniem metod z zakresu: bioinformatyki, genetyki, bio-chemii i mikrobiologii wykazały, że HP0231 pomimo strukturalnego podobieństwa do białka DsbG E. coli jest w komórce H. pylori oksydazą i funkcjonalnym odpowiednikiem DsbA E. coli. Przeprowadzono również eksperymenty, które wykazały, że partnerem redoks białka HP0231, który odpowiada za utrzymanie go w formie utlenionej, jest DsbI. Porównanie su-bproteomów białek peryplazmatyczych szczepu dzikiego i mutantów H. pylori w genach szla-ku utleniania Dsb nie pozwoliło na zidentyfikowanie bezpośrednich substratów szlaku utle-niania, ale wykazano, że jego funkcjonowanie może wpływać na aktywność białek odpowie-dzialnych za odpowiedź patogenu na stres oksydacyjny. Druga część prezentowanej rozprawy doktorskiej dotyczy charakterystyki białka nale-żącego również do rodziny Dsb – HP0377. Analizy bioinformatyczne przeprowadzone w ra-mach prezentowanej pracy wskazały, że HP0377, pomimo przypisanej mu adnotacji przez róż-ne bazy danych jako homologa DsbC, pełni prawdopodobnie w komórce H. pylori funkcję DsbE/CcmG. Homologi DsbE z różnych mikroorganizmów zaangażowane są w proces doj-rzewania cytochromów c, a dokładniej w redukcję apocytochromów c na terenie peryplazmy, co umożliwia dołączenie hemu. W celu potwierdzenia przeprowadzonych analiz bioinforma-tycznych przebadano właściwości biochemiczne i genetyczne białka HP0377. Udokumento-wano, że w teście redukcji insuliny, który pozwala na określenie właściwości redukujących oksydoreduktaz, HP0377 wykazuje bardzo słabą aktywność, co jest cechą charakterystyczną białek CcmG, a wartość jego potencjału redoks jest zbliżona do potencjału redoks białka CcmG E. coli. Wykazano także, że w komórkach H. pylori HP0377 jest lipoproteiną zakotwi-czoną w błonie cytoplazmatycznej i występuje w formie zredukowanej. Analiza stanu redoks HP0377 w komórkach mutantów w genach biorących udział w szlaku wprowadzania most-ków disiarczkowych (hp0231, hp0595) nieoczekiwanie wykazała, że procesy w których biorą udział badane białka są ze sobą powiązane. Hipoteza badawcza zakłada, że po transporcie do peryplazmy apocytochrom c ulega utlenieniu przez HP0231, a następnie jest redukowany przez HP0377. Białko HP0377, którego ekspresja zachodzi w komórkach E. coli, występuje w formie utlenionej a nie zredukowanej jak w komórkach natywnego gospodarza, co sugeruje brak białka Dsb odpowiedzialnego za jego redukcję. Dodatkowo udokumentowano, że nie komplementuje ono mutacji w genach dsbA i dsbC E. coli. Pomimo licznych prób nie powio-dło się stworzenie mutanta w genie hp0377, co może wiązać się z faktem, iż HP0377 jest biał-kiem niezbędnym do przeżycia bakterii. Otrzymane dane eksperymentalne sugerują rolę HP0377 w procesie dojrzewania apocytochromu c, choć weryfikacja tej hipotezy wymaga przeprowadzenia dalszych badań. Podsumowując, przeprowadzone eksperymenty doprowadziły do scharakteryzowania pierwszej występującej w formie dimeru oksydoreduktazy (HP0231) funkcjonującej w szlaku utleniania Dsb oraz udokumentowały, że HP0377, białko opisane jako homolog DsbC, jest odpowiednikiem DsbE/CcmG. Jasno dokumentują one odmienność systemu Dsb H. pylori oraz wskazują jak bardzo ograniczona jest nasza wiedza o jego funkcjonowaniu.