Studies of the structure and function of human antiviral IFIT protein complexes

Białka IFIT (ang. interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats) są białkami efektorowymi wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u kręgowców. W odpowiedzi na stymulację interferonem liczba ich cząsteczek w pojedynczej komórce wzrasta do milionów kopii. Zahamowanie infekcji wirusowej następuje poprzez związanie wirusowego RNA przez białka IFIT i uniemożliwienie jego translacji. U człowieka występują 4 paralogi IFIT: IFIT1, IFIT2, IFIT3 i IFIT5 o różnej specyficzności względem sekwencji i końca 5’ RNA. Białka IFIT1 i IFIT5 rozpoznają „obce” RNA w oparciu o wiązanie 5’ końca nietypowego dla cytoplazmy komórki, raczej niż w oparciu o sekwencję RNA. IFIT5 specyficznie wiąże trójfosforylowane RNA, natomiast IFIT1 preferencyjnie rozpoznaje kap 0 RNA. W przeciwieństwie do IFIT1 i IFIT5, IFIT2 charakteryzuje się specyficznością sekwencyjną i rozpoznaje sekwencję bogatą w adeninę i uracyl. W przypadku białka IFIT3 nie zaobserwowano oddziaływania z RNA. Białka IFIT1, IFIT2 i IFIT3 tworzą kompleksy o niepoznanym do końca składzie i funkcji. W związku z tym, że każde z tych białek ma inną specyficzność względem RNA, ich oddziaływania sugerują istnienie kompleksów o odmiennych lub kombinatorycznych właściwościach. Celem projektu doktorskiego było otrzymanie heterooligomerów tworzonych przez pary białek IFIT (IFIT1/2, IFIT1/3, IFIT2/3), jak i oligomeru wyższego rzędu (IFIT1/2/3) i ich charakterystyka pod względem struktury i specyficzności względem RNA. Badania obejmowały również analizę składu i funkcji kompleksów białek IFIT w ludzkich komórkach linii A549 po stymulacji interferonem β oraz na skutek infekcji wirusowej jak również zidentyfikowanie partnerów białkowych dla poszczególnych białek IFIT. W celu przeprowadzenia badań in cellulo, wyprowadzono linie komórkowe A549- 3xFLAG-IFIT1, A549-3xFLAG-IFIT2 i A549-3xFLAG-IFIT3. Używając lizatów białkowych otrzymanych z tych komórek oraz stosując immunoprecypitację na złożu anty-FLAG i metodę Western blot potwierdzono wzajemne oddziaływanie białek IFIT zarówno po stymulacji komórek interferonem β 1A jak również po infekcji wirusem RSV. Analiza kompleksów białek IFIT przy użyciu spektrometrii mas pozwoliła zidentyfikować inne białka oddziałujące z białkami IFIT, które były różne w zależności od rodzaju stymulacji ekspresji białek IFIT. Przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej potwierdzono bezpośrednie oddziaływanie białek IFIT tj.: IFIT1 z IFIT2, IFIT1 z IFIT3 oraz IFIT2 z IFIT3 w badanych liniach komórkowych. Aby sprawdzić, czy interakcja ta zostanie zaburzona w przypadku braku jednego z białek IFIT, wyprowadzono linie komórkowe A549 z wyciszeniem ekspresji genu kodującego IFIT1, IFIT2 lub IFIT3 przy użyciu metody CRISPR/Cas9. W przypadku wyciszenia ekspresji IFIT3 zaobserwowano zmniejszenie się ekspresji IFIT2, co uniemożliwiło analizę interakcji dla pary białek IFIT1-IFIT2. W przypadku wyciszenia białka IFIT1 lub IFIT2 można było zaobserwować niezmieniony poziom odpowiednio kompleksów IFIT2 z IFIT3 lub IFIT1 z IFIT3. Równolegle, analizowano wzajemne oddziaływania między białkami IFIT w warunkach in vitro. Oczyszczono białka IFIT1, IFIT2 i IFIT3, jak również opracowano metodę ko-ekspresji i oczyszczania heterooligomeru IFIT2 i IFIT3. Potwierdzono, z zastosowaniem metody SEC-MALS, że każde z białek IFIT tj. IFIT1, IFIT2 i IFIT3 tworzy homodimery (IFIT1/1, IFIT2/2, IFIT3/3). Co więcej białka IFIT1 i IFIT2 oraz IFIT1 i IFIT3 tworzyły heterotetrametry, natomiast IFIT2 i IFIT3 tworzyły głównie heterodimer (IFIT2/3), a IFIT1 z IFIT2 i z IFIT3 – heterotrimer (IFIT1/2/3). W związku z ukazaniem się publikacji innych autorów dotyczących charakterystyki heterooligomeru białek IFIT1 i IFIT3 jak również opisujących analizę specyficzności oligomerów białek IFIT1 i IFIT3 oraz IFIT1, IFIT2 i IFIT3 względem kap 0 RNA, w dalszej części pracy analizowano oligomery tworzone przez IFIT2 (IFIT2/2, IFIT1/2, oraz IFIT2/3). Określenie specyficzności wiązania białek IFIT względem RNA rozpoczęto od analizy sekwencji RNA rozpoznawanej przez IFIT2/2, IFIT1/2 oraz IFIT2/3 metodą SELEX. Na bazie wykrytych motywów RNA i wykorzystując metodę termoforezy w skali mikro (MST) wyznaczono pozorne stałe wiązania RNA dla homodimeru IFIT2/2 i heterodimeru IFIT2/3. Wykazano zmianę specyficzności względem rozpoznawanego RNA w zależności od tego, czy białko IFIT2 jest homodimerem, czy heterodimerem (IFIT2/3). Specyficzność wiązania różnych struktur drugorzędowych RNA przez białka IFIT została też przeanalizowana z zastosowaniem testu opóźnionej migracji w żelu poliakryloamidowym (EMSA). W przeciwieństwie do dostępnych danych literaturowych wykazano, że zarówno homodimer IFIT2/2 jak i heterodimer IFIT2/3 wiążą się z większą specyficznością do jednoniciowego RNA niż do RNA dwuniciowego lub o strukturze spinki. Specyficzność względem jednoniciowego RNA potwierdziły też doświadczenia typu „pull-down” z użyciem rekombinowanego kompleksu IFIT2/2 lub IFIT2/3 i całkowitego RNA wyizolowanego z komórek A549 zakażonych wirusem grypy A/California/07/2009 (H1N1). Zarówno w przypadku IFIT2/2 jak i IFIT2/3 wzbogaceniu uległo wirusowe mRNA/cRNA. Natomiast komplementarne do niego vRNA nie wiązało się z białkami IFIT. Na podstawie sekwencjonowania RNA, wzbogaconego w tym doświadczeniu, wykazano również, że IFIT2/2 i IFIT2/3 różnią się specyficznością względem rozpoznawanego RNA komórkowego. Badania strukturalne kompleksów IFIT2/2 z RNA oraz IFIT2/3 z RNA przeprowadziłam z użyciem krystalografii rentgenowskiej i kriomikroskopii elektronowej. W przypadku tej drugiej metody udało się uzyskać model struktury homodimeru IFIT2/2 z RNA w dwóch stanach konformacyjnych o rozdzielczości odpowiednio 3.73 i 3.8 Å. W przypadku kompleksu IFIT2/3 z RNA uzyskano modele heterodimeru i heterotetrameru tych białek (w obydwu przypadkach bez widocznego C-końcowego fragmentu białka IFIT3) z RNA o rozdzielczości 3.31 i 3.95 Å. Wykazano, że w IFIT2/3 helisy nr 7-9 wymieniają się między monomerami tworząc stabilny heterodimer. W okolicach C-końcowej części IFIT2 widać niewymodelowany potencjał elektrostatyczny, który najprawdopodobniej odpowiada związanemu w tym miejscu RNA. Reasumując, w trakcie przeprowadzonych badań potwierdzono bezpośrednią interakcję białek IFIT1, IFIT2 i IFIT3 między sobą w komórkach linii A549. Wytypowano też najbardziej prawdopodobnych partnerów białkowych. Porównano właściwości IFIT2/2 oraz IFIT2/3 pod względem struktury kompleksu białko-RNA i preferowanej sekwencji oraz struktury wiązanego RNA. Uzyskane wyniki wraz z dostępnymi danymi literaturowymi nt. heterooligomeru IFIT1/3 stanowią podstawę do badania kompleksów wyższego rzędu tworzonych przez białka IFIT. W dalszej perspektywie mogą one posłużyć lepszemu zrozumieniu funkcji i regulacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej.

IFIT proteins (Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats) are some of the key effectors of the vertebrate innate immune response upon viral infection. They sequester viral RNAs and prevent their translation to proteins. Upon interferon stimulation IFIT proteins are very highly expressed reaching millions of protein copies per cell. In humans, the IFIT protein family consists of 4 paralogs: IFIT1, IFIT2, IFIT3 and IFIT5, which have different RNA binding specificity. The recognition of “non-self” RNA by IFIT1 and IFIT5 is based on an atypical 5’ end rather than on the RNA sequence. IFIT5 recognises 5’ triphosphorylated RNA while IFIT1 has higher affinity towards cap 0 RNA. In contrast to IFIT1 and IFIT5, IFIT2 is believed to bind double-stranded adenine/uracil-rich RNA, but the way it interacts with RNA is unknown (no co-crystal structure with RNA is available). In case of IFIT3 no RNA binding was reported and it likely plays a supporting role for IFIT1 and IFIT2. IFIT1, IFIT2 and IFIT3 proteins form complexes whose composition and function have not been fully resolved. Since each of these IFIT proteins has a different RNA specificity, their interactions suggest the existence of a larger complex with different or combinatorial properties. The aim of the project was to obtain binary IFIT heterooligomers (IFIT1/2, IFIT1/3, IFIT2/3), as well as the higher-order oligomers (IFIT1/2/3) and to characterise these oligomers in terms of structure and RNA specificity in vitro. The studies also included the analysis of the composition and function of IFIT protein complexes in human A549 cells after stimulation with interferon β or upon viral infection, and identification of other partners of IFIT proteins. For in cellulo studies A549-3xFLAG-IFIT1, A549-3xFLAG-IFIT2 and A549-3xFLAG-IFIT3 cell lines were established. Using lysates from these cell lines and performing immunoprecipitation coupled with Western blot, the interaction of IFIT1, IFIT2 and IFIT3 with one another, both after interferon β 1A stimulation or after RSV infection, was confirmed. Moreover, mass spectrometry analysis revealed other partners of IFIT proteins, which were different for these two kinds of stimulation. Using a proximity ligation assay (PLA), the direct pairwise interaction between IFIT1-IFIT2, IFIT1-IFIT3 and IFIT2-IFIT3 was confirmed. To check whether this interaction is altered in the absence of one of the IFIT proteins, the monoclonal IFIT1, IFIT2 or IFIT3 knock-out A549 cell lines were generated using the CRISPR/Cas9 method. Interestingly, upon IFIT3 silencing, a decrease in the IFIT2 expression was observed. This did not allow analysing the IFIT3-independent interaction of IFIT1 with IFIT2. However, co-immunoprecipitation revealed that upon IFIT1 or IFIT2 silencing, the IFIT2-IFIT3 or IFIT1-IFIT3 complexes, respectively, have still been formed. In parallel, interactions between IFIT proteins were analysed in vitro. IFIT1, IFIT2 and IFIT3 were purified, and a method for co-expression and purification of IFIT2/3 complex was developed. By SEC-MALS analysis, it was confirmed that each IFIT protein: IFIT1, IFIT2 and IFIT3 formed homodimers (IFIT1/1, IFIT2/2 and IFIT3/3). Interestingly, IFIT1 with IFIT2 and IFIT1 with IFIT3 formed heterotetramers, IFIT2 with IFIT3 mainly formed a heterodimer (IFIT2/3) while IFIT1 with IFIT2 and with IFIT3 – a heterotrimer (IFIT1/2/3). Due to the fact that during the PhD project, the characteristics of the IFIT1/3 heterooligomer and the analysis of the RNA specificity of the IFIT1/3 and IFIT1/2/3 towards cap 0 RNA were published, the investigation of the IFIT2 oligomers (IFIT2/2, IFIT1/2, and IFIT2/3) became my main goal. First, the RNA sequence specificity of IFIT2 oligomers was analysed using the SELEX method. Then, the apparent binding constants towards the detected RNA motifs for both the IFIT2/2 homodimer and the IFIT2/3 heterodimer were determined using the microscale thermophoresis (MST) method. A change in RNA specificity has been shown depending on whether the IFIT2 protein formed a homodimer or a heterodimer (IFIT2/3). In addition, the specificity of IFIT proteins for RNA secondary structure was determined using using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Contrary to the available literature data, both IFIT2/2 homodimer and IFIT2/3 heterodimer have been shown to bind with greater affinity to single-stranded RNA as compared to double-stranded RNA, or to hairpin RNA. Single stranded RNA specificity was also confirmed by pull-down experiments using recombinant GST-tagged IFIT2/2 homodimer and IFIT2/3 heterodimer and total RNA isolated from A549 cells infected with Influenza A/California/07/2009 (H1N1) virus. For both IFIT2/2 and IFIT2/3, viral mRNA/cRNA was enriched. However, the vRNA (complementary to mRNA/cRNA) did not bind to IFIT2/2 homodimer or IFIT2/3 heterodimer. RNA sequencing data from this experiment also showed that these dimers differ in specificity towards cellular RNA targets. In the next step, the structural analysis of complexes formed by IFIT2/2 and IFIT2/3 homo- and heterodimers with RNA were conducted using X-ray crystallography and cryogenic electron microscopy (cryo-EM). In the case of cryo-EM, the models of IFIT2/2 homodimer with RNA in two conformational states (“open” and “closed”) were obtained with a resolution of 3.73 and 3.8 Å, respectively. In the case of IFIT2/3, the models of the heterodimer and the heterotetramer (both lacking a C-terminal fragment of the IFIT3 protein) with RNA bound were obtained with a resolution of 3.31 and 3.95 Å, respectively. In both cases (IFIT2/2 and IFIT2/3) the helices 7- 9 were exchanged between interacting monomers to form stable homo- or heterodimers. In the vicinity of the C-terminal part of the IFIT2, an unmodeled electrostatic potential was visible, which indicated that RNA was bound there. Altogether, the direct interactions between IFIT1, IFIT2 and IFIT3 proteins were confirmed in A549 cell lines. The most likely partners of IFIT proteins have been identified. The properties of IFIT2/2 and IFIT2/3 homo- and heterodimers in terms of the protein-RNA complex structure and the preferred RNA were determined. The results obtained during realisation of this PhD project and the available literature data on the IFIT1/3 oligomers are a good foundation for the analysis of higher-order IFIT complexes and for better understanding of the function and regulation of the innate immune response.