Rola anten LHCII w aklimatyzacji do jakości i natężenia światła chloroplastów mezofilowych i pochew okołowiązkowych kukurydzy

Kukurydza jest rośliną o typie metabolicznym C4 podtypu NADP-ME, posiada w liściach dwa typy chloroplastów: mezofilowe (M) oraz pochew okołowiązkowych (BS) zróżnicowane strukturalnie i funkcjonalnie. Podstawowym procesem stanowiącym szybką odpowiedź chloroplastów na stres świetlny jest zjawisko przejścia stanów. W literaturze przedstawione są wyniki badań dotyczące głównie chloroplastów roślin typu C3 i brak jest danych jak ten proces zachodzi w chloroplastach roślin C4. W szczególności brak prac, w których badano by zmiany organizacji fotosystemów i ich anten w bezgranowych chloroplastach kukurydzy. W pracy badano aklimatyzację chloroplastów kukurydzy do zmiennych warunków światła. Stosowano trzy natężenia światła podczas wzrostu roślin: niskie, średnie i wysokie (odpowiednio 80, 200 i 800 µmol fotonów m-2 s -1 ). Wykorzystano też zjawisko preferencyjnego wzbudzania fotosystemów światłami dalekiej czerwieni i czerwieni w celu wywołania szybkiej odpowiedzi chloroplastów M i BS. W pracy posłużono się techniką fluorescencji niskotemperaturowej (77K) pozwalającej badać zmiany w organizacji kompleksów tylakoidowych wiążących chlorofil. Mierzono aktywność fotosystemów przy użyciu elektrody tlenowej Clarka. Do zbadania super i megakompleksów tylakoidowych wykorzystano między innymi elektroforezę niedenaturującą, immunodetekcję, oczyszczanie kompleksów na gradientach sacharozowych. Wykazano, że w chloroplastach mezofilowych kukurydzy zachodzi proces przejścia stanów polegający na odłączaniu się anten LHCII od PSI-LHCII i przyłączaniu do PSII w warunkach preferencyjnego pobudzania fotosystemu I światłem dalekiej czerwieni. Udowodniono, że w bezgranowych chloroplastach BS nie zachodzi klasyczny proces przejścia stanów, ponieważ pobudzanie PSI nie prowadzi do odłączania się anten LHCII od tego fotosystemu, w BS występuje permanentny stan 2. Natomiast wolne anteny LHCII łączą się w dużej ilości z PSII zmieniając znacząco jego fluorescencję w temperaturze 77K. Udowodniono, że w chloroplastach mezofilowych kukurydzy występują trzy typy kompleksów, w których ma udział PSI: monomer PSI-LHCI, PSI-LHCI-LHCII-Lhcb4 oraz kompleksy PSI-LHCII-PSII. Udało się scharakteryzować je pod względem składu białkowego i zaproponowano budowę przestrzenną. U kukurydzy w kompleksie PSI-LHCI-LHCII-Lhcb4 nie występuje białko Lhcb3. Istnieje pogląd, że Lhcb3 jest kluczowym białkiem w przejściu stanów. Zbadano zmiany wywołane daleką czerwienią w zawartości trzech typów megakompleksów, występujących w chloroplastach izolowanych z liści roślin rosnących w niskim (LL) i wysokim (HL) natężeniu światła. Stwierdzono, że światło preferencyjnie wzbudzające PSI prowadzi do rozpadu kompleksu PSI-LHCI-LHCII-Lhcb4 i tworzenia megakompleksów PSI-PSII w chloroplastach z LL oraz rozpad obu kompleksów w chloroplastach z HL. Po raz pierwszy zaproponowano metodę badania kinetyki enzymatycznej fotosystemów z wykorzystaniem światła jako substratu. Pokazano, że reakcja enzymatyczna PSII ze względu na światło jako substrat jest kinetyką Michealisa-Menten (M-M) przy czym parametr kinetyczny Km związany jest z „efektywnością” przyłączonych anten. W przypadku PSI rozszerzono model M-M, tworząc nowy model kinetyki enzymatycznej dla fotosystemów, w którym występuje proces odłączania/przyłączania anten. Wyznaczono w tym modelu parametr [𝑆�]1⁄2 będący odpowiednikiem parametru kinetycznego Km w modelu M-M i będący miarą funkcjonalnie przyłączonych anten LHCII do PSI. Kontrolowano ilość przyłączonych anten do fotosystemów poprzez ekspozycję na światło preferencyjnie wzbudzające fotosystemy i adaptację do ciemności, regulując poziom ścieniania gran. Określono związek pomiędzy ilością anten związanych z fotosystemem a parametrami kinetycznymi. Zbadano również kinetykę enzymatyczną fotoosystemów ze względu na stężenie sztucznych akceptorów elektronów dla chloroplastów mezofilowych kukurydzy. W przypadku PSI wprowadzono model kinetyki dwusubstratowej, w którym substraty: tlen i metylowiologen konkurują o miejsce katalityczne PSI. Pozwoliło to na wyznaczenie stałej 𝐾�𝑚� 𝑂� = 124 μM, która jest związana z powinowactwem tlenu do PSI i jest ilościową miarą reakcji Mehlera. Na tej podstawie stwierdzono, że reakcja Mehlera może mieć znaczący udział (nawet do 33%) w transporcie elektronów przez PSI. Rozszerzono model M-M tak, aby opisywał kinetykę enzymatyczną PSII zakładając, że substratem jest sztuczny akceptor elektronów 2,6-dichloro 1,4-benzochinon (DCBQ). Dzięki temu udowodniono, że DCBQ ma jednocześnie właściwości akceptora jak i inhibitora PSII. Przeprowadzone badania i proponowane układy eksperymentalne są nowatorskie i dostarczają informacji podnoszących stan wiedzy o reakcjach świetlnych fotosyntezy u roślin C4. Natężenie i jakość światła jako sygnał indukujący zmiany funkcjonalno-strukturalne chloroplastów pozwoliły uzyskać odpowiedź na pytanie w jaki sposób kukurydza, roślina C4, posiadająca zróżnicowane funkcjonalnie i strukturalnie chloroplasty mezofilowe i pochew okołowiązkowych przystosowuje się do zmieniającego się oświetlenia, które warunkuje wysoką aktywność fotosyntetyczną. Zaproponowano molekularne mechanizmy tych przystosowań. Badania te dostarczyły również informacji o zależności pomiędzy lokalizacją chloroplastów M i BS, a ich funkcją modyfikowaną przez światło

The purpose of this research was to examine the acclimation processes occurring in the maize chloroplasts during growth of plants in different light intensity and quality. Photosynthesis of C4 plants involves mesophyll (M) and bundle sheath (BS) chloroplasts, which differ structurally and functionally, and cooperate with each other during photosynthesis. The main aim of the work was to explain the “state transitions” process, which is considered, a short-term response of a photosynthetic apparatus to light stress. In the literature studies focus on the C3 plants, thus the data are not available how this process works in C4 plants. In particular, there is lack of information concerning changes in the organization of photosystems and their antenna in agranal chloroplasts (BS) of maize. Research presents the acclimation of maize chloroplasts to the changes in light conditions. Experiments were carried out on the chloroplasts isolated from the leaves of plants grown in at low, moderate and high light intensity (70, 350 and 800 µmol photons m−2 s −1 , respectively). Also, was used the red and far red light which preferentially excite the photosystems (PSII and PSI, respectively) to induce the short-term response of photosynthetic apparatus. In the work, low-temperature fluorescence techniques were used allowing to examine the changes in the organization of thylakoid chlorophyll binding complexes. The activity of photosystems was done by measurements oxygen-evolving activities using a Clarktype oxygen-electrode under saturating white light. To identify the compositions of super-, and megacomplexes was used two-dimensional electrophoresis (BlueNative/SDS PAGE) and immunodetection with appropriate antibodies, and fractionation of complexes on sucrose gradients. It has been shown that in the mesophyll chloroplasts of maize occurs the classic “state transitions” process, where FR-light induced dephosphorylation of LHCII and the detachment of antenna from PSI occurred. In the BS thylakoids, the FR light initiated dephosphorylation of free and aggregated LHCII antenna, the dephosphorylated antenna can bound to PSII (State 1), thereby significantly increase fluorescence at 77K, while part of LHCII pool is bound with PSI. Thus, my data indicate for the first time that PSI in agranal bundle sheath chloroplasts of maize is locked in State 2. It has been detected in M chloroplasts three types of PSI complexes: PSI-LHCI monomer, PSI-LHCI-LHCII-Lhcb4 and PSI-LHCII-PSII. They are characterized by protein composition and spatial structure is proposed. It is shown that in PSI-LHCI-LHCII-Lhcb4 megacomplex Lhcb3 protein was not identified. So far it is considered, that the Lhcb3 is a key protein in the “state transitions”. Exposition of plants from high and low light growth condition on FR light induces different rearrangements in the composition of super- and megacomplexes, what indicate that it is related not only to balancing light absorption by photosystems, but these complexes also seems to play a role for PSI in excitation quenching and in PSII turnover. Is proposed for the first time, a method of the enzymatic kinetics of photosystems using light as substrate. It has been shown that for PSII it is Michealis-Menten kinetics (M-M) with the parameter Km related to the "efficiency" of the connected antenna. In the case of PSI, the Michaelis-Menten model was expanded, creating a new model in which the process of antenna association/dissociation occurs. In this model, the parameter [𝑆]1⁄2 was determined, which is equivalent to the kinetic parameter Km in the M-M model and is a functional association of LHCII antennas with PSI. Was determined the relationships between the amount of antenna associated with photosystem and kinetic parameters. The enzymatic kinetics of photosystems was also examined considering the concentration of artificial acceptors of electrons for M chloroplasts. For PSI, a two-substrate kinetics model was introduced in which the substrates were: oxygen and methylviologen competing for the PSI active site. It allowed to determined constant 𝐾𝑚 𝑂 = 124 𝜇𝑀, which is related to the affinity of oxygen for PSI and is a quantitative value of the Mehler reaction. On this basis, it was found that the Mehler reaction can have a significant contribution (up to 33%) in electron transport via PSI. The M-M model was extended to describe the PSII enzymatic kinetics assuming that the substrate artificial electron acceptor 2,6-dichloro-1,4-benzoquinone (DCBQ), acts as both an acceptor and inhibitor of PSII. The conducted research and proposed experimental systems are innovative and provide information extended the state of knowledge about the light reactions of photosynthesis of C4 plants. The intensity and quality of light as a signal inducing functional and structural changes in chloroplasts have allowed to answer the question how maize C4 plant, having functionally and structurally differentiated chloroplasts (M and BS), acclimatize to changing light condition. These studies also provide information on the relationship between the location of chloroplasts and their function modified by light. Submolecular mechanisms of acclimation is proposed.