Zmiany w homeostazie wapnia u rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) indukowane żywieniem amonowym

Uprawa większości roślin, w tym rzodkiewnika pospolitego, z wykorzystaniem jonów amonowych (NH4 + ) jako jedynego źródła azotu (N) prowadzi do poważnych zaburzeń ich rozwoju określanych ogólnie jako syndrom amonowy. Dotychczas przyczyny toksyczności NH4 + nie zostały w pełni wyjaśnione. Wiadomo, że w wyniku żywienia amonowego dochodzi m.in. do zaburzenia równowagi jonowej w tkankach roślin. Celem pracy doktorskiej było określenie, w jakim stopniu deficyt jonów wapnia (Ca2+) w tkankach liści rzodkiewnika przyczynia się do powstawania syndromu amonowego. Przeprowadzone badania skupiły się na precyzyjnym określeniu wpływu obecności NH4 + w pożywce jako jedynego źródła N na: (i) zawartość, transport i lokalizację Ca2+ w komórkach i tkankach liści; (ii) właściwości biomechaniczne ścian komórkowych związane z ograniczeniem wzrostu komórek; oraz (iii) aktywację ścieżek sygnałowych zależnych od Ca2+ . Wykazano, że obserwowany w warunkach żywienia amonowego deficyt Ca2+ w tkankach liści był w znacznym stopniu spowodowany upośledzeniem transportu długodystansowego. Co więcej, u roślin rosnących w obecności NH4 + jako jedynego źródła N również transport wewnątrzkomórkowy Ca2+ uległ znaczącej modyfikacji. Zmiany poziomu ekspresji genów kodujących transportery Ca2+ oraz analiza zawartości Ca2+ w cytozolu i apoplaście wskazały, że u roślin wykorzystujących NH4 + jako jedyne źródło N doszło do akumulacji Ca2+ w przestrzeniach pozakomórkowych przy jednoczesnym obniżeniu zawartości tych jonów w cytozolu. Wykazano także, że pomimo deficytu Ca2+ w tkankach liści, żywienie amonowe nie zaburzyło aktywacji ścieżek sygnałowych zależnych od Ca2+ w warunkach dodatkowego stresu abiotycznego – chłodu i zasolenia. W kolejnych etapach badań wykorzystano rośliny transgeniczne oeCAX1, u których nadekspresji uległ gen CAX1.3 pozbawiony domeny autoinhibitorowej. Jego białkowy produkt – tonoplastowy antyporter Ca2+/H+ (CAX1), poprzez akumulację w wakuoli Ca2+ pochodzących z cytozolu pośrednio reguluje stężenie tych jonów w przestrzeni pozakomórkowej. Wykazano, że żywienie amonowe w znacznie mniejszym stopniu hamowało wzrost roślin linii oeCAX1 w porównaniu do typu dzikiego. Pomimo braku różnic w całkowitej zawartości Ca2+ w tkankach liści roślin transgenicznych i typu dzikiego, stwierdzono mniejszą ich zawartość w apoplaście roślin linii oeCAX1 w stosunku do roślin kontrolnych rosnących w obecności NH4 + jako jedynego źródła N. Analiza biomechaniczna ścian komórkowych (m.in. sztywności i rozciągliwości tych struktur) wykazała odmienny wpływ żywienia amonowego na ich właściwości u roślin linii oeCAX1 i typu dzikiego, jednak nie udało się wskazać bezpośredniego powiązania stwierdzonych zmian z obniżonym poziomem Ca2+ w przestrzeni pozakomórkowej w tkankach liści roślin transgenicznych. Modyfikacje homeostazy wapnia wywołane żywieniem amonowym są jedną z istotnych przyczyn syndromu amonowego. Wydaje się jednak, że stres ten nie upośledza istotnie ścieżek sygnałowych zależnych od Ca2+, lecz zmienia komórkową dystrybucję Ca2+ . Ponadto stres amonowy modyfikuje właściwości biomechaniczne ścian komórkowych.

Cultivation of most plants, including Arabidopsis thaliana, using ammonium ions (NH4 + ) as the sole nitrogen (N) source leads to severe disturbances in their development, generally referred to as the ammonium syndrome. So far, the causes of NH4 + toxicity have not been fully explained. It is known that NH4 + feeding results in ionic imbalances in plant tissues including calcium. The aim of the dissertation was to determine how a deficit of calcium ions (Ca2+) in Arabidopsis leaves contributes to the development of ammonium syndrome. The research focused on determining the impact of NH4 + as the only N source on: (i) content, transport and localization of Ca2+ in leaf tissues; (ii) biomechanical properties of cell walls; and (iii) activation of Ca2+ -dependent signaling pathways. It has been shown that the Ca2+ deficit in leaf tissues observed under NH4 + nutrition is mainly caused by reduced long-distance transport of ions in the xylem. Ammonium stress also significantly alters intracellular Ca2+ transport. Changes in the expression level of genes encoding Ca2+ transporters and analysis of Ca2+ content in the cytosol and apoplast indicate that the use of NH4 + as the sole N source leads to the accumulation of Ca2+ in extracellular space, with a simultaneous reduction in its cytosolic ion content. Moreover, it was also shown that despite the Ca2+ deficiency in leaf tissues, NH4 + feeding did not disturb the activation of Ca2+ - dependent signaling pathways induced by additional abiotic stresses - cold and salinity. For further research, transgenic oeCAX1 plants overexpressing the CAX1.3 gene lacking the autoinhibitory domain were used. CAX1 is a tonoplast Ca2+/H+ antiporter that indirectly regulates Ca2+ concentration in the extracellular space by importing cytosolic Ca2+ into vacuoles. Ammonium feeding inhibits the growth of oeCAX1 plants to a much lesser extent than it does in wild-type plants. Despite no differences in total Ca2+ content in the leaves of oeCAX1 and wild-type plants, a lower content of these ions was found in the apoplast of oeCAX1 plants compared to controls grown in the presence of NH4 + . Biomechanical analysis of cell walls indicates a different effect of NH4 + nutrition on the properties of cell walls in the leaves of oeCAX1 and wild-type plants, but it is not possible to directly link this to changed extracellular Ca2+ level. Modifications of calcium homeostasis caused by NH4 + nutrition are one of the important causes of the ammonium syndrome. However, it appears that these stress conditions do not significantly impair Ca2+ -dependent signaling pathways, but instead change the cellular distribution of Ca2+. Moreover, ammonium stress alters the biomechanical properties of cell walls.