Defining the role of mobile DNA in shaping the pangenome and adaptation to environmental stresses of Listeria spp. (Firmicutes)

Rodzaj taksonomiczny Listeria (typ Firmicutes) grupuje zarówno bakterie niepatogenne dla ludzi, jak i groźne fakultatywne patogeny wewnątrzkomórkowe. Najlepiej poznany gatunek, L. monocytogenes, wywołuje listeriozę – chorobę o ciężkim przebiegu często prowadzącą do śmierci. Szczepy Listeria spp. są powszechnie izolowane z wody, gleby i roślinności. Do zakażenia dochodzi głównie w następstwie spożycia zanieczyszczonego pokarmu, dlatego obecność tych bakterii jest szczególnie uważnie monitorowana w produktach spożywczych i zakładach przetwórstwa żywności. Chromosomy bakterii z rodzaju Listeria cechuje konserwowana struktura genetyczna, w której identyfikuje się niewielką ilość egzogennego DNA. Postawiono zatem hipotezę, że w tym przypadku, pozachromosomowe replikony – plazmidy, odgrywają kluczową rolę: (a) w determinowaniu zakresu pangenomu całego rodzaju taksonomicznego, a także (b) w kształtowaniu zmienności fenotypowej poszczególnych szczepów, która jest podstawą adaptacji tych bakterii do warunków stresowych. W momencie rozpoczęcia badań, w bazie danych GenBank dostępne były kompletne sekwencje nukleotydowe jedynie 29 plazmidów Listeria spp., z których aż 26 pochodziło ze szczepów L. monocytogenes. Weryfikacja przedstawionej wyżej hipotezy wymagała jednak wiedzy o znacznie większej puli plazmidów, pochodzących z szerszego spektrum gatunków Listeria. W ramach badań zgromadzono więc własną kolekcję 143 szczepów Listeria spp., które wyizolowano z prób gleby i wody pochodzących ze środowisk o zróżnicowanej presji antropogenicznej. Do badań włączono również: (a) dostępną w Instytucie Mikrobiologii UW kolekcję 627 szczepów wyizolowanych z różnych produktów spożywczych oraz z linii produkcyjnych krajowych zakładów przetwórstwa spożywczego, a także (b) 12 szczepów wyizolowanych z prób środowiskowych w Stanach Zjednoczonych (USA). Szczepy te scharakteryzowano pod względem profili oporności na wybrane metale ciężkie oraz związki o działaniu antybakteryjnym, co było pomocne w dalszej części pracy, podczas identyfikacji genetycznych modułów fenotypowych plazmidów. W rezultacie, zbadano obecność plazmidów łącznie w 782 szczepach reprezentujących 7 gatunków Listeria, co doprowadziło do identyfikacji 374 replikonów o wielkości w zakresie od 4 kb do 100 kb. Plazmidy te pogrupowano na podstawie analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), wyróżniając 59 grup replikonów o odmiennych wzorach restrykcyjnych. Odczytano kompletne sekwencje nukleotydowe reprezentantów poszczególnych grup RFLP – łącznie 55 plazmidów pochodzących z sześciu gatunków 2 Listeria. Pozwoliło to niemal podwoić pulę dostępnych w tym czasie w bazach danych sekwencji plazmidów tych bakterii, a także poznać pierwsze kompletne sekwencje replikonów pozachromosomowych niektórych gatunków (L. seeligeri, L. welshimeri i L. ivanovii). Uzyskane dane zintegrowano z danymi dostępnymi w bazie GenBank, co pozwoliło na przeprowadzenie kompleksowych analiz plazmidomu Listeria spp., złożonego z puli 113 replikonów pochodzących z różnych gatunków, izolowanych z różnych nisz ekologicznych, w różnym czasie i w różnych lokalizacjach geograficznych. Dokonano manualnej adnotacji wszystkich sekwencji nukleotydowych, a następnie przeprowadzono ich szczegółowe analizy bioinformatyczne. Pozwoliło to na zdefiniowanie konserwowanego rdzenia genomów plazmidowych, a także poszczególnych modułów genetycznych (m.in. systemów replikacyjnych, systemów transferu, determinant oporności), których funkcje eksperymentalnie zweryfikowano. Zaobserwowano, że niemal wszystkie plazmidy kodują pokrewne białka inicjacji replikacji (RepA), które są charakterystyczne dla replikonów z grupy niezgodności Inc18. Analizy porównawcze wykazały również bardzo wysoki stopień syntenii i konserwacji sekwencji nukleotydowych rozległych segmentów DNA plazmidów; zasugerowały także kluczową rolę elementów transpozycyjnych w kształtowaniu architektury genomów tych replikonów. W trakcie badań scharakteryzowano również dodatkowy ładunek genetyczny plazmidów, wykazując obecność licznych modułów o znaczeniu adaptacyjnym. Umożliwiło to m.in. identyfikację determinant oporności, w tym nieopisanego wcześniej w literaturze wariantu genu oporności na kadm (cadA6C6), którego funkcję potwierdzono eksperymentalnie. Przedstawiona rozprawa doktorska stanowi pierwszą tak obszerną charakterystykę plazmidomu Listeria spp. Dzięki analizie dużej liczby całkowitych sekwencji nukleotydowych plazmidów, pochodzących z różnych gatunków i źródeł izolacji, możliwe było oszacowanie roli plazmidów i niesionych przez nie transpozonów w biologii tych bakterii. Określono również rolę poznanych dotąd plazmidów w kształtowaniu pangenomu rodzaju Listeria. W toku badań oszacowano także skalę wymiany informacji genetycznej między plazmidami a chromosomami Listeria spp., a także między plazmidami Listeria spp. a plazmidami z innych rodzajów taksonomicznych z typu Firmicutes, co przyniosło informacje na temat kierunków i zakresu przepływu egzogennej informacji genetycznej w tej grupie bakterii.

Bacteria of the genus Listeria (phylum Firmicutes) include both human and animal pathogens, as well as saprophytic strains. Most studies focus on L. monocytogenes – a facultative intracellular pathogenic bacterium causing an important food-borne infection, called listeriosis, which has a high death mortality. Listeria spp. are commonly detected in diverse environments including soil, surface waters and vegetation, and their presence in agricultural habitats can be a potential source of food contamination. The primary cause of listeriosis infections is ingestion of contaminated food products, therefore the presence of Listeria spp. in the food industry is very closely monitored. Listeria chromosomes have a stable, conserved genetic structure and show limited integration of foreign DNA, which suggests that plasmids may play a vital role in the shaping of the pangenome (set of all genes present in members of a species or genus) and phenotypic variation of bacteria from the genus Listeria. The main aim of this study was to determine the role of plasmids in shaping the pangenome of Listeria spp. and their impact on adaptive abilities of the bacteria. At the starting point of this study, only 29 complete nucleotide sequences of Listeria plasmids were available in public databases, of which 26 were isolated form L. monocytogenes strains. Therefore, plasmids were isolated from a large collection of diverse Listeria spp. strains originating from various environments. As part of this project, 143 strains were isolated from soil and water samples collected from natural, agricultural and urban areas. Additionally, 12 environmental strains were provided by the Food Safety Laboratory at Cornell University in the USA and 627 strains originating from food products and food production sites were provided by the Department of Molecular Microbiology, University of Warsaw. The plasmid content was analyzed in the entire collection of 782 strains representing 7 species. A total of 374 plasmids (4-100 kb in size) were isolated and classified into 59 groups based on their plasmid RFLP patters. The complete nucleotide sequences of 55 plasmids, representing different RFLP profiles, were obtained. These included the first published complete sequences of plasmids from L. welshimeri, L. seeligeri and L. ivanovii species. The obtained data was combined with all complete Listeria plasmid sequences available at that time in GenBank. As a result, a total of 113 unique complete plasmid sequences, isolated from different countries, sources and belonging to various Listeria 2 species, were analyzed. Their structure, diversity, conserved backbone and additional genetic load was studied in-depth. Selected modules, involved in replication, conjugative transfer and cadmium resistance were experimentally tested. The plasmidome of Listeria was dominated by a group of related replicons encoding the RepA replication initiation protein of the Inc18 group. Comparative analyses revealed that many of the plasmids have similar structures and share numerous highly conserved DNA segments. Their genomes harbor numerous transposable elements, which probably had a large impact on the plasmid architecture. The replicons also encode multiple genes of adaptive value putatively involved in resistance to antibiotics, heavy metals, metalloids and sanitizers, and responses to heat, oxidative, acid and high salinity stressors. Moreover, a novel cadmium-resistance efflux system variant was identified (cadA6C6) and shown to be functional in L. monocytogenes strains. This study provides the first large-scale in-depth insights into the structure and genetic load of plasmids occurring in bacteria od the genus Listeria, including species other than L. monocytogenes. In order to draw more general conclusions, a large number of plasmids were analyzed, which originated from strains of various Listeria species as well as diverse sources, years of isolation and countries of origin. Listeria plasmids encode multiple genes that may contribute to the bacteria’s ability to colonize various environments and adapt to unfavorable conditions. The role of these plasmids in shaping the pangenome and the rate of DNA transfer between plasmids and chromosomes was analyzed. Due to their low diversity, Listeria plasmids seem to have a limited impact on the size of the Listeria pangenome. Based on pangenome analyses and protein-based similarity networks it was shown that most Listeria plasmids form a tight cluster of highly related replicons, and share many genes with plasmids of other Firmicutes, which proves their common evolutionary history.