Elektrochemiczne badania oddziaływań plazmidowego DNA z substancjami o właściwościach przeciwnowotworowych, przeciwgrzybicznych, przeciwbakteryjnych i przeciwutleniających

Przedstawiona praca doktorska dotyczy oddziaływania DNA z różnymi związkami chemicznymi, takimi jak: przeciwnowotworowe, przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze i przeciwutleniające. Pierwszym etapem każdego z eksperymentów było zaadsorbowanie DNA na powierzchni elektrody z węgla szklistego. Akumulację DNA prowadzono przez kilka godzin z roztworu DNA, którego stężenie było bardzo niskie, rzędu pg/ml, zamiast zwykle stosowanego μg/ml. Tak długa i żmudna procedura okazała się korzystna dla uzyskania jednolitej i powtarzalnej warstwy DNA. Jako przykład związków przeciwnowotworowych badano pochodne (-Cl, -Et, -Me) związku o skrócie IPBD. W każdym przypadku obserwowano kompleksowanie plazmidów, czemu towarzyszyła kondensacja warstwy DNA-związek. Wynik ten można wykorzystać jako dowód oddziaływania między DNA i potencjalnymi lekami przeciwnowotworowymi, co prowadzi do wniosku, że takie interakcje mogą być kluczowe dla działania przeciwnowotworowego związku IPBD i jego pochodnych. Aby udowodnić kompleksowanie DNA przez potencjalne związki przeciwnowotworowe, oprócz metod elektrochemicznych, zastosowano również metody spektroskopowe. Na podstawie danych UV-Vis obliczono stałe trwałości kompleksów DNA-związek, które wynosiły ok. 10^5 M-1. Widma CD wykazały zmianę struktury DNA z dodatkiem każdego potencjalnego leku przeciwnowotworowego. Nie było jednak jasne, do jakiej formy DNA zostało przekształcone, początkowo prawdopodobnie z B-DNA w A-DNA. Następnie przewidywano, że Z-DNA może być częściowo utworzone ze wzrostem stężenia badanych związków. W rzeczywistości wykazano wyraźną zmianę z B-DNA na Z-DNA dla mieszaniny potencjalnego związku przeciwnowotworowego Cl-IPBD i pentamidyny, jak również samej pentamidyny oraz dla roślinnego ekstraktu Uncaria tomentosa. Do badań zastosowano pentamidynę, czyli związek o znanym sposobie oddziaływania z DNA, który lokuje się w małym rowku helisy kwasu deoksyrybonukleinowego, tak, aby odpowiedzieć na pytanie w jaki sposób potencjalne związki przeciwnowotworowe oddziałują z DNA. Przeprowadzone eksperymenty polegały na sprawdzeniu czy pentamidyna zakumulowana w warstwie DNA może zostać zastąpiona przez potencjalny związek przeciwnowotworowy (lub odwrotnie). Rzeczywiście, takie podstawienie zostało udowodnione, co prowadzi do wniosku, że IPBD i jego pochodne mogą oddziaływać z DNA w małym rowku. Należy również podkreślić, że pentamidyna i mieszanina tej substancji z potencjalnym związkiem przeciwnowotworowym (Cl-IPBD) została przetestowana biologicznie na komórkach rakowych. Zarówno pentamidyna, jak i Cl-IPBD wykazywały właściwości cytotoksyczne, ale było zaskakujące, że połączenie tych leków okazało się bardziej skuteczne niż każdy z nich stosowany osobno. Nie tylko Cl-IPBD, ale także inne potencjalne związki przeciwnowotworowe, a mianowicie IPBD Me-IPBD i Et-IPBD, zostały również biologicznie przetestowane. Każdy związek wykazywał właściwości cytotoksyczne. Co ważne, różnice wykryte między tymi pochodnymi dobrze korelują z różnicami w akumulacji związków w plazmidach, wykrytymi jednocześnie za pomocą metod elektrochemicznych. Pomimo tego, w przedstawionej pracy testowano tylko dwa związki będące typowymi substancjami przeciwbakteryjnymi i przeciwgrzybiczymi, zauważono znaczące podobieństwa w obrębie każdej grupy i różnice między grupami, co sugeruje różne sposoby oddziaływania z DNA. Substancje przeciwbakteryjne są trudne do utlenienia na elektrodzie GC w przeciwieństwie do substancji przeciwgrzybiczych, które łatwo się utleniają, podobnie jak związki przeciwnowotworowe. Różnice obserwuje się także w stopniu kondensacji w warstwach DNA-związek. W przeciwieństwie do potencjalnych związków przeciwnowotworowych, przeciwbakteryjnych, przeciwgrzybiczych, rutyny i U. tomentosa, witamina C, której utlenianie można łatwo badać elektrochemicznie, nie powoduje kondensacji DNA, co ponownie potwierdza znaczenie efektu kondensacji w innych przypadkach.

Extremely important initial experiments on the interactions of DNA with various substances such as: anticancer, antibacterial and antifungal compounds started with creating a DNA-film electrode. The DNA film was formed on a typical Glassy Carbon electrode using extremely low DNA concentrations in solution, pg/mL instead of usually used µg/mL, but long time of DNA accumulation, up to a few hours. Such long and tedious procedure proved to be beneficial for obtaining a uniform and reproducible DNA layer. As an example of the anticancer drugs, the derivatives (-Cl, -Et, -Me) of the compound abbreviated as IPBD were studied. In every case, the complexation of plasmids was detected and was accompanied by the condensation within the DNA-compound layer. This result can be used as a proof of strong interactions between DNA and potential anticancer drugs, leading to the conclusion that such interactions might be crucial for the anticancer action of the IPBD compound and its derivatives. To prove the complexation of the DNA by these potential anticancer drugs, except for electrochemical, also the spectroscopic methods were used. From UV-Vis, the change in spectra were observed and the stability constants were calculated (in the range of 10^5 M-1). The CD spectra showed the change of the DNA structure with the addition of each potential anticancer drug. It was not clear, however, to which form of the plasmid DNA was transformed, initially probably form B-DNA into A-DNA. Then, with increasing concentration of the incorporated compound, it was anticipated that Z-DNA might be partially formed with increasing concentration of the incorporated compounds. In fact, a definite change from B-DNA to Z-DNA was indeed shown with the addition of pentamidine to accompany the potential anticancer drug Cl-IPBD as well as for the extract of Uncaria tomentosa. Pentamidine was basically studied to shed the light on the type of interactions between the potential anticancer drugs and DNA. Pentamidine incorporated into the oligonucleotide is one of a few examples of compounds which crystal structure is known and the accumulation in a specific part of the DNA helix called minor groove is proven. Therefore, I have used pentamidine to test whether it can be substituted by a potential anticancer drug (or vice versa). Indeed, such a substitution was proven, leading to the conclusion that IPBD and its derivatives might interact with DNA specifically in the minor groove. It should also be mentioned that pentamidine and the mixture of this compound with a potential anticancer drug Cl-IPBD was tested biologically on cancer cells. Both pentamidine and Cl-IPBD showed anticancer properties, but surprisingly, the combination of these drugs was more effective than each of them used separately. Not only Cl-IPBD, but also other potential anticancer drugs, namely the derivatives of IPBD were also tested biologically. Each compounds showed anticancer properties. Importantly, the differences detected between these derivatives correlated well with the differences in accumulation of the compounds within the plasmids, as detected simultaneously using electrochemical methods. Even though only two compounds were tested as typical antibacterial as well as antifungal substances, significant similarities were noticed within each group and differences between the groups, suggesting various modes of interactions with DNA. The antibacterial substances are difficult to oxidize on the GC electrode in contrast to antifungal substances which oxidize easily, similarly to the anticancer drugs. The differences are also observed in the degree of condensation within the DNA-compound films. In contrast to the interactions of anticancer, antibacterial and antifungal compounds, rutin and U. tomentosa, with plasmids, vitamin C, which oxidation can easily be studied electrochemically, does not cause the DNA condensation, proving again the importance of the condensation effect in other cases.